重组腺相关病毒(AAV)是FDA批准的体内基因治疗载体，在心血管基础和转化研究中被广泛应用。AAV血清型9 (AAV9)具有高度心脏亲和性。AAV9结合心脏肌钙蛋白T (Tnnt2,又称cTNT)启动子是最常用的向心肌中特异性递送基因的载体。但是，AAV9-Tnnt2载体的组织特异性评估尚不充分，这种载体在除心脏外的其他器官如果造成基因表达泄漏会造成难以预测的后果。因此，对该载体进行更严格的生物分布评估，并进行针对性的优化，对于心脏研究和基因治疗具有重要意义。

2024年5月28日，北京大学基础医学院、北京大学心血管研究所、血管稳态与重构全国重点实验室郭宇轩研究员团队在Circulation杂志上发表题为“MicroRNA-122-mediated liver detargeting enhances the tissue specificity of cardiac genome editing”的论文^[1]。该研究基于Cre-LoxP、CRISPR/Cas9等超敏DNA记录技术，发现AAV9-Tnnt2载体在肝脏中广泛泄漏表达。利用microRNA-122在肝脏组织中高度特异性表达的特点，该团队在AAV9-Tnnt2转基因的3’-UTR引入miR122的靶序列(miR122TS)，大幅度降低了AAV9-Tnnt2在肝脏组织中的表达泄漏，提高了其心脏特异性。利用这种优化的载体，该团队通过静脉注射AAV，成功实现心肌特异性的CaMKIIδ单碱基编辑失活，显著缓解心梗小鼠模型的疾病表型，并且不造成额外肝损伤。因此，本研究构建了更加严格的心脏特异性AAV体内基因递送载体，实现了AAV在心脏研究中的技术升级。

1. AAV9-Tnnt2载体肝泄露现象的发现

为了评估AAV9-Tnnt2载体的组织特异性，作者首先构建了AAV骨架序列完全相同的AAV9-Tnnt2-GFP和AAV9-Tnnt2-Cre两种基因表达载体。这两种AAV递送至R26^fsCas9-GFP小鼠体内后，AAV9-Tnnt2-GFP能直接表达GFP，而AAV9-Tnnt2-Cre 可激活R26^fsCas9-GFP，间接激活GFP表达。这种实验设计使研究者能够直接对比GFP和Cre-LoxP两种报告技术的差异。作者通过共聚焦成像检测心脏、肝脏、脾脏、肺脏等各组织器官的报告基因表达情况，发现递送AAV9-Tnnt2-GFP的小鼠仅在心脏组织中能检测到GFP信号，而递送AAV9-Tnnt2-Cre的小鼠，除心脏组织外，在肝脏组织中也能检测到GFP信号。上述现象在另一种报告小鼠R26^{fsCas9-tdTomato}中能够进一步验证。这些数据证实了AAV9-Tnnt2载体存在广泛的肝脏泄漏表达。虽然AAV9-Tnnt2-GFP由于灵敏度的限制，在肝脏中难以检测到信号，但是在Cre-Loxp这种高灵敏度的检测手段下，AAV9-Tnnt2载体的肝脏泄露变得尤为明显(图A-C)。

CRISPR/Cas9基因编辑技术也是一种对于低水平、瞬时基因表达高度灵敏的DNA记录技术，因此作者猜想AAV9-Tnnt2递送的基因编辑也会存在肝脏泄露问题。围绕这个假说，作者针对心脏疾病的一个通用治疗靶点—Camk2d基因设计sgRNA，构建了AAV9-Tnnt2-SaCas9载体，发现该载体可以特异性地敲除心脏组织中的CAMK2D蛋白(钙离子/钙调蛋白依赖性激酶IIδ, CaMKIIδ)。扩增子测序结果显示，在肝脏组织中，sgRNA靶向的Camk2d基因位点产生了约10-20%的DNA插入/缺失突变(indels)，达到了心脏组织中indels产生率的一半，且这种泄漏与小鼠的年龄及AAV的皮下/静脉给药方式无关(图D, E)。这表明AAV9-Tnnt2驱动的转基因在CRISPR/Cas9的应用中也存在严重的肝脏泄漏表达。

2. 利用miR122TS实现肝脏去靶向性

为了降低这种肝脏泄漏表达，接下来作者对AAV9-Tnnt2载体进行了优化。MicroRNA-122 (miR122)是一种肝脏特异性表达，在microRNA中丰度最高，且介导基因沉默的microRNA。向AAV的3’-UTR引入miR122的靶向序列(miR122TS)时，肝脏中的microRNA能有效降低泄漏至肝脏的AAV转录表达^{[2, 3]}。作者向AAV9-Tnnt2载体的3’-UTR引入miR122TS，发现在Cre-Loxp报告系统中能有效降低R26^{fsCas9-tdTomato}小鼠肝脏中Cre的mRNA表达和荧光报告基因的表达，并且基本不影响肝脏内源性的基因表达(图F-H)。miR122TS的序列在人和小鼠中完全相同。作者向人肝癌细胞系Huh7中递送AAV，也发现引入miR122TS能有效降低AAV在人源细胞中的转基因表达(图I)。

在CRISPR/Cas9应用场景中，向AAV9-Tnnt2载体的3’-UTR引入miR122TS也能有效降低小鼠肝脏组织基因编辑的泄漏(indels发生率)。CRISPR/Cas9基因编辑在DNA双链断裂处会促进AAV基因组向宿主基因组的整合^[4]。通过qPCR检测，作者发现miR122TS显著降低了AAV9-Tnnt2-Cas9载体在肝脏中整合基因组的程度，同时不改变AAV9整合心脏基因组的能力(图J-L)。这些结果进一步证实了miR122TS降低 AAV9-Tnnt2载体造成肝损伤的风险。

3. 利用AAV9-Tnnt2-miR122TS载体实现心脏碱基编辑疗法

Eric Olson实验室近期通过腺嘌呤单碱基编辑器(ABE)消除CAMK2D的氧化位点，在小鼠心肌缺血模型中实现了心肌保护和心功能恢复^[5]。为了研究miR122TS对这种基因编辑疗法的作用，作者向AAV-ABE的3’-UTR引入miR122TS，皮下注射递送至新生小鼠体内，发现miR122TS能有效降低ABE在肝脏中的泄漏表达和泄漏编辑，并且在心脏、肝脏外的其他组织器官也不会造成额外编辑(图M)。作者进一步将AAV-ABE-miR122TS载体通过尾静脉注射递送至心梗三天后的小鼠体内，发现这种优化的AAV-ABE载体能显著地改善小鼠心脏功能，并且不会造成额外的肝损伤 (图N-O)。

综上所述，本文发现AAV9-Tnnt2载体在肝脏中存在广泛的低水平泄漏表达。这种现象通常不影响该载体在心肌细胞中特异性地过表达基因，但是在Cre-LoxP、CRISPR/Cas9和ABE等对低表达基因灵敏度极高的应用场景中会造成严重的肝脏泄漏情况。在AAV转基因的3’UTR中引入miR122TS是消除AAV9-Tnnt2载体的肝脏泄漏缺陷的有效手段，是实现心肌细胞特异性的体内基因编辑的关键技术。作者期待通过这些技术的改进，能有效推进AAV在心脏研究和基因治疗中的应用。

北京大学基础医学院2021级博士生杨璐梓和刘占钊是本研究的共同第一作者。郭宇轩研究员是本研究的通讯作者。本工作获得了波士顿儿童医院William Pu教授、北京大学崔庆华教授、华西附二院李一飞/郑焱江教授、安贞医院高霏教授、阜外医院陈亮教授、上海大学周平主教授和北京协和医院胡晓敏教授的大力支持与合作。本研究获得国家自然科学基金、国家重点研发计划和北京市科技新星计划的资助。

参考文献:

[1] Yang L, Liu Z, Chen G, et al. MicroRNA-122-Mediated Liver Detargeting Enhances the Tissue Specificity of Cardiac Genome Editing. Circulation, 2024, 149(22): 1778-1781

[2] Geisler A, Jungmann A, Kurreck J, et al. microRNA122-regulated transgene expression increases specificity of cardiac gene transfer upon intravenous delivery of AAV9 vectors. Gene Ther, 2011, 18(2): 199-209

[3] Qiao C, Yuan Z, Li J, et al. Liver-specific microRNA-122 target sequences incorporated in AAV vectors efficiently inhibits transgene expression in the liver. Gene Ther, 2011, 18(4): 403-410

[4] Hanlon KS, Kleinstiver BP, Garcia SP, et al. High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks. Nat Commun, 2019, 10(1): 4439

[5] Lebek S, Chemello F, Caravia XM, et al. Ablation of CaMKIIδ oxidation by CRISPR-Cas9 base editing as a therapy for cardiac disease. Science, 2023, 379(6628): 179-185