复杂区域疼痛综合征(CRPS)是一种继发于创伤或基础疾病后，主要发生于四肢且顽固难治的疼痛综合征，常伴有区域性自主神经功能紊乱、运动功能受损、组织营养不良及微循环变化(水肿、体温调节障碍)等^[1-2]。CRPS在人群中的发生率为26.2/10万人年，根据其与交感神经的关系，可分为Ⅰ型(无明确神经损伤)和Ⅱ型(伴明确神经损伤证据)，其病理机制尚未明确，临床治疗效果较差^[3-4]。

Wnt信号通路在神经发育中对细胞增殖分化起重要作用，不同特异性配体结合 Frizzled（卷曲蛋白）受体和共受体LRPs(低密度脂蛋白受体家族)通过依赖 β-catenin（β连环蛋白）的经典信号通路和非经典信号通路发挥生物学效应，其中关键性Wnt5a配体可通过调控神经损伤修复及炎症反应参与慢性疼痛的发生^[5-7]。

基质金属蛋白酶（MMP）不仅可切割水解组织蛋白，还可降解炎症因子、趋化因子以及神经递质受体等^[8]。近期研究发现，MMP9在脑损伤、神经退行性疾病、胶质瘤及慢性疼痛进展中发挥重要作用^[9-10]。Martin等^[11]研究指出，表皮生长因子受体通过激活MMP9及PI3K/AKT/mTOR通路增强伤害性感受。

此外，基于CRPS患者血液组织的蛋白互作网络及富集分析发现差异基因MMP9在炎症反应中扮演重要角色^[12]。Rodriguez-Trillo 等^[13]研究发现，敲低内源性Wnt5a能够抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α)诱导的MMP9水平升高，从而抑制类风湿关节炎中成纤维样滑膜细胞引起的炎症反应。因此，MMP9可能是介导疼痛外周敏化的重要靶点之一。

本研究通过对人永生化角质形成细胞HaCaT进行氧糖剥夺/复氧(OGD/R)处理及建立大鼠患肢缺血再灌注慢性缺血后疼痛(CPIP）模型(模拟CRPS-Ⅰ型)，探讨角质形成细胞Wnt5a通过靶向调控MMP9进而参与CRPS外周敏化的机制，旨在为临床治疗CRPS提供指导依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物

成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

本研究已通过北京协和医院实验动物福利伦理委员会审批(审批号：XHDW-2022-149)。

1.1.2 材料及主要试剂

HaCaT［由国家生物医学实验细胞资源库(NSTI-BMCR)提供］，Box5(Wnt5a抑制剂，P121601，Sel-leck，美国)，培养基(MEM) α(112571063, Gibco, 美国), 10%胎牛血清(16000044，Gibco，美国)，1%青霉素-链霉素(15140-122，Gibco, 美国)，MMP9(ab283575，Abcam，英国)，JC-1试剂盒(C2006，碧云天生物公司，中国), 角蛋白keratin(ab8068，Abcam, 英国)， 苏木素-伊红染色试剂盒(C0105S，碧云天生物公司，中国), IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒(ZC-36391，茁彩，中国)，TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒(ZC-37624，茁彩，中国)。

1.2 分组与干预

1.2.1 体外实验

将生长状态良好的HaCaT细胞取对数生长期接种于6孔板，并随机分为OGD/R组、Box5（20）组、Box5(40)组和对照组。OGD/R损伤模型建立：弃去完全培养基后，PBS润洗3次，添加无糖培养基及厌氧包置于细胞培养箱3 h,之后更换高糖培养基进行复糖复氧。

1.2.2 动物实验

SD大鼠适应性饲养2周后，随机分为CPIP组、Box5(20)组、Box5(40)组和对照组，每组8只。CPIP组、Box5(20)组、Box5(40)组先建立缺血再灌注CPIP模型：采用40 mg/kg(2%)戊巴比妥腹腔注射麻醉，将内径0.56 cm O型环套入大鼠右后肢踝关节处，造成肢端缺血，3 h后剪断O型环，模拟缺血后再灌注过程。参考体外细胞实验给药剂量并稀释药物浓度^[14]，对照组和CPIP组分别抽取生理盐水100 μL，Box5(20)组和Box5(40)组分别抽取20 μmol/L和40 μmol/L Box5溶液100 μL，于大鼠右后肢足底中间完成皮下注射。

1.3 观察指标及具体方法

OGD/R早期(24 h内)观察角质形成细胞HaCaT线粒体损伤及膜电位变化。通过疼痛行为学测定观察不同处理组2周内不同时间点［第1天（D1），D2，D4，D10，D14］机械痛和热痛阈值变化情况。HE染色观察大鼠皮肤炎症浸润及角化情况，免疫荧光染色观察不同处理组MMP9表达情况，ELISA检测不同处理组背根神经节(DRG)IL-1β及TNF-α水平。

1.3.1 线粒体膜电位测定

向生长状态良好的HaCaT细胞中加入JC-1染色工作液，于细胞培养箱中37 ℃孵育20 min，之后离心3～4 min(600×g, 4 ℃)，用JC-1染色缓冲液洗涤沉淀细胞2次，再用适量JC-1染色缓冲液重悬后，用荧光显微镜观察。正常状态下JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物J-aggregates(红色荧光)；当线粒体受损而膜电位下降时，JC-1无法聚集在线粒体基质中而呈现单体状态Monomer(绿色荧光)。使用ImageJ软件计算绿色/红色荧光强度相对比例以分析线粒体膜电位变化情况。

1.3.2 机械痛阈值测定

将大鼠单独放置于可自由活动的透明有机玻璃笼内，底部为金属网底，适应30 min后，用von Frey Filaments垂直刺激大鼠右后足底中部，缓慢用力至出现突然缩足、舔足或扬足反应为阳性。每足至少测量3次，每次至少间隔30 s，取平均值作为机械缩足反射阈值^[15]。

1.3.3 热痛阈值测定

将大鼠单独放置于可自由活动的玻璃透明笼中，适应30 min后,用热辐射疼痛刺激仪照射大鼠右后足底, 大鼠产生快速缩足、舔足或扬足反应为阳性，记录照射持续时间。每足至少测量3次，间隔10 min以上，取平均值作为热刺激缩足反射的潜伏期^[15]。

1.3.4 免疫荧光染色

取出制作好的皮肤冰冻切片，室温干燥30 min, 用含0.1% Triton X-100的PBS漂洗3次,每次5 min,用含 0.5% Triton X-100的PBS室温孵育30 min, 5%山羊血清抗体封闭液室温封闭1 h, 4 ℃孵育一抗过夜(MMP9 1:100, keratin 1:100)。皮肤切片室温平衡30 min, PBS漂洗3次, 室温下避光孵育二抗90 min［山羊抗鼠 IgG(Alexa Fluor^® 488)(1:500)和山羊抗兔 IgG(Alexa Fluor^® 594)(1:500)］, PBS漂洗3次, 含DAPI的封片剂封片,荧光显微镜下观察拍照。

1.3.5 HE染色

在D14时间点麻醉大鼠并将其处死，快速取患足皮肤。经不同浓度的乙醇溶液进行逐级脱水, 二甲苯澄清, 进行浸蜡、包埋切片制作，HE染色后凝胶密封, 置于显微镜下观察。

1.3.6 ELISA检测

用预冷的PBS冲洗DRG组织，加入相应蛋白酶抑制剂充分混合后，在冰上研磨。将匀浆液5000×g离心5～10 min，取上清检测。标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL。样本孔中加入待测组织50 μL。每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，并用封板膜封孔。37 ℃恒温箱温育60 min后每孔加满洗涤液350 μL并静置1 min，重复洗板5次。每孔加入相应底物并避光孵育15 min。加入终止液50 μL后在450 nm波长处测定各孔的OD值并计算相应组织浓度。

1.4 统计学处理

采用 SPSS 软件（Chicago，IL，USA）进行统计学分析，并用Graphpad prism 9软件作图。痛阈值等符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较选用LSD-t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HaCaT细胞OGD/R后MMP9表达变化

对生长状态良好的HaCaT细胞进行缺氧及无糖培养基处理3 h,与对照组相比，OGD/R组MMP9荧光强度显著增加（P＜0.001）;与OGD/R组相比，Box5(20)组(P=0.002）及Box5(40)组(P＜0.001)MMP9相对荧光强度均显著下降，不同浓度Wnt5a抑制剂组间比较差异无统计学意义（P=0.320），见图1。

图1 HaCaT细胞OGD/R后不同处理组角质形成细胞MMP9表达变化(标尺=20 μm, ×20)

2.2 Box5对HaCaT细胞OGD/R后线粒体影响

透射电镜下观察HaCaT细胞OGD/R后早期出现线粒体明显萎缩，线粒体嵴发生形态结构紊乱。JC-1荧光探针检测显示，与对照组相比，OGD/R组绿/红荧光比例显著增加（P=0.027），提示线粒体膜电位下降；与OGD/R组相比，Box5(40)组线粒体膜电位有所上升，差异具有统计学意义（P=0.046），见图2。

图2 Wnt5a抑制剂Box5对HaCaT细胞线粒体影响

A.透射电镜下OGD/R组线粒体萎缩情况(标尺=500 nm)；B.JC-1染色检测各组线粒体膜电位变化(标尺=20 μm, ×20)

2.3 大鼠CPIP后行为学改变

与对照组相比，CPIP组大鼠术后各时间点（D1，D2，D4，D10，D14）机械痛阈值和热痛阈值均显著降低(P均＜0.05)；与CPIP组相比，Box5(40)组在D4和D14时间点机械痛阈值改善具有统计学差异(P＜0.05), 在D4，D10和D14时间点热痛阈值明显上升(P＜0.05)。Box5(20)组与Box5(40)组在D4和D14时间点机械痛阈值差异具有统计学意义，而热痛阈值在各个时间点均无明显差异，见图3。

图3 大鼠建模给药流程图（A）及造模后疼痛行为学改变（B）

2.4 CPIP后患足表皮HE染色及免疫荧光染色

D14时间点麻醉后，处死大鼠并取材患足皮肤进行HE染色。与对照组相比，CPIP组大鼠患足真皮层出现大量炎症细胞浸润，表皮出现过度角化，颗粒层及棘层厚度显著增加(P＜0.001)；与CPIP组相比，Box5(40)组颗粒层及棘层厚度降低明显(P＜0.001)，见图4A。

图4A CPIP后患足表皮HE染色及免疫荧光染色结果(×20)  A.大鼠患足表皮HE染色

D14时间点麻醉后处死大鼠并取材患足皮肤进行免疫荧光试验。与对照组相比，CPIP组角质形成细胞MMP9荧光强度显著增加(P＜0.001)；与CPIP组相比，Box5(20)组(P=0.002)和Box5(40)组(P＜0.001)MMP9荧光强度均显著下降, 不同浓度组间比较无统计学差异(P=0.480)，见图4B。

图4B CPIP后患足表皮HE染色及免疫荧光染色结果(×20)  B.大鼠患足表皮免疫荧光染色(标尺=20 μm)

2.5 大鼠CPIP后DRG组织炎症因子改变

D14时间点麻醉后处死大鼠取DRG组织，ELISA法检测炎症因子IL-1β及TNF-α浓度。与对照组相比，CPIP组IL-1β(P=0.048)和TNF-α浓度( P=0.002)显著升高; 与CPIP组相比，Box5(40)组IL-1β(P=0.047)和TNF-α浓度( P=0.047)显著下降，见图5。

图5 大鼠CPIP后DRG组织IL-1β、TNF-α水平改变

CPIP：同图3

3 讨论

CRPS是重要的慢性疼痛综合征之一，其病理生理机制较为复杂，近年来是疼痛领域的研究热点。目前大量研究证实Wnt信号通路中关键性配体Wnt5a在慢性疼痛机制中发挥重要作用^[16-17]，但其是否与CRPS的发生相关尚无研究报道。

Ji等^[18]研究指出MMP常作为炎性反应的下游产物而在慢性疼痛进展过程中显著升高，其中以MMP9和MMP2升高尤为明显。同样，Pan等^[19]研究发现，靶向抑制MMP9的活性可有效抑制坐骨神经损伤引起的神经病理性疼痛。本研究以此为切入点，通过体外、动物双重实验，探究角质形成细胞Wnt5a通过调控MMP9参与CRPS的外周敏化机制。

3.1 Wnt5a参与调控线粒体膜电位

Shan等^[20]研究表明，体外培养的星形胶质细胞进行OGD/R处理后MMP9表达显著上升，体内胰高血糖素样肽-1受体激动剂Ex-4能够降低MMP9的表达，进而保护血脑屏障。同样，本研究发现HaCaT细胞OGD/R后MMP9表达明显上升，Wnt5a特异性抑制剂Box5能够显著降低MMP9的荧光强度，然而不同浓度(20 μmol/L和40 μmol/L)间未发现统计学差异，尚需进一步探究。

OGD/R处理早期会产生活性氧（ROS），ROS的过度积累能够导致线粒体膜通透性增加，进而引起线粒体跨膜电位降低，表现为线粒体萎缩及细胞色素C释放，诱导细胞凋亡的发生并激活凋亡蛋白酶caspase，进一步导致炎症和疾病的产生^[21-22]。本研究通过透射电镜发现在HaCaT细胞OGD/R早期(24 h内)线粒体出现明显萎缩，线粒体嵴发生形态结构损伤，采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位发现OGD/R组电压显著下降，给予40 μmol/L Box5能够抑制膜电位电压的下降，可能与阻断ROS的过度积累有关。

3.2 Wnt5a抑制剂逆转痛觉敏化

CRPS临床主要表现为自主神经症状(出汗、血管舒缩功能异常)、运动障碍和营养性改变(皮肤、骨骼萎缩、毛发减少、关节挛缩)等^[23-24]。慢性缺血后疼痛模型CPIP是目前国际上公认的CRPS动物模型，通过延长缺血时间(3 h)，能够完全模拟CRPS-Ⅰ型患者病理生理过程^[25-26]。Lu等^[7]研究发现，降低小鼠体内Wnt5a水平能够显著抑制SNI小鼠的神经性疼痛和神经炎症，缓解患足的机械超敏反应。

本研究发现，CPIP建模后各时间点(D1, D2, D4, D10, D14)机械痛阈值和热痛阈值均明显下降，通过局部注射Wnt5a抑制剂能有效缓解大鼠的慢性疼痛。HE染色显示，CPIP组大鼠患足真皮层出现大量炎症细胞浸润，建模早期大鼠患足出现明显肿胀，后期表皮出现过度角化，颗粒层及棘层厚度显著增加, 而Box5(40)组角化程度较低。

3.3 Wnt5a调控MMP9参与CRPS外周敏化

目前，MMP9被认为是参与神经炎症的关键因子,在多种动物模型中证实其可以通过对细胞因子等的剪切活化，触发下游信号通路的激活导致神经病理性疼痛的产生^[27-29]。

本研究发现，大鼠患足缺血再灌注损伤后角质形成细胞上MMP9表达显著上调，Wnt5a抑制剂能够降低MMP9的表达同时逆转痛觉超敏反应，但未发现降低程度存在剂量依赖性。

MacLauchlan等^[30]研究发现，类风湿关节炎小鼠靶向敲除Wnt5a后，MMP2和MMP9的表达显著降低，炎症细胞浸润程度改善，软骨破坏活动受到抑制。

同样，Jang等^[31]指出，由脂多糖诱发人支气管上皮细胞BEAS-2B和人脐静脉内皮细胞HUVEC导致的炎症反应可被Wnt拮抗剂DKK-1和LGK974所抑制，炎症因子TNF- α、IL-1β及MMP9随之下降，降低程度与Wnt抑制剂呈剂量依赖性。因此，靶向抑制Wnt5a/MMP9信号通路的激活将有效抑制炎症的持续进展，一定程度缓解CRPS患者的慢性疼痛。

本研究主要关注外周敏化在CRPS病理生理过程中发挥的重要作用，其中Wnt5a/MMP9信号通路的激活及炎症反应发挥重要作用。此外，本研究ELISA结果提示CPIP组大鼠DRG水平IL-1β及TNF-α浓度显著升高，局部外周注射高浓度Wnt5a抑制剂能够有效抑制炎症的持续进展。然而，MMP9通过何种路径被Wnt5a激活，其上行至中枢的具体机制尚需实验进一步探究。

综上，通过体内体外双重实验，本研究初步证实外周局部缺血导致皮肤角质细胞MMP9的过表达，引发持续性外周敏化，导致CRPS-Ⅰ型的发生。局部应用Wnt5a抑制剂可逆转MMP9的过度表达及大鼠疼痛行为，靶向抑制外周Wnt5a/MMP9可为临床治疗该慢性痛提供参考依据。

参考文献

［1］Shim H, Rose J, Halle S, et al. Complex regional pain syndrome: a narrative review for the practising clinician［J］. Br J Anaesth, 2019, 123(2): e424-e433.

［2］Louis M H, Meyer C, Legrain V, et al. Biological and psychological early prognostic factors in complex regional pain syndrome: a systematic review［J］. Eur J Pain, 2023, 27(3): 338-352.

［3］Smart K M, Ferraro M C, Wand B M, et al. Physiotherapy for pain and disability in adults with complex regional pain syndrome (CRPS) types Ⅰ and Ⅱ［J］. Cochrane Database Syst Rev, 2022, 5(5): CD010853.

［4］Sobeeh M G, Hassan K A, Silva A G, et al. Impact of different CRPS phenotypes and diagnostic criteria on quantita-tive sensory testing outcomes: systematic review and meta-analysis［J/OL］. Pain Med: pnad144. https://doi.org/10.1093/pm/pnad144.

［5］Xie Y K, Luo H, Zhang S X, et al. GPR177 in A-fiber sensory neurons drives diabetic neuropathic pain via WNT-mediated TRPV1 activation［J］. Sci Transl Med, 2022, 14(639): eabh2557.

［6］Liu X, Bae C, Liu B L, et al. Development of opioid-induced hyperalgesia depends on reactive astrocytes controlled by Wnt5a signaling［J］. Mol Psychiatry, 2023, 28(2): 767-779.

［7］Lu Y T, Zhang J T, Zeng F N, et al. Human PMSCs-derived small extracellular vesicles alleviate neuropathic pain through miR-26a-5p/Wnt5a in SNI mice model［J］. J Neuroinflammation, 2022, 19(1): 221.

［8］Li J, Ruan S R, Jia J H, et al. Hydrogen attenuates postoperative pain through Trx1/ASK1/MMP9 signaling pathway［J］. J Neuroinflammation, 2023, 20(1): 22.

［9］Deng W D, Ding Z B, Wang Y Y, et al. Dendrobine attenuates osteoclast differentiation through modulating ROS/NFATc1/MMP9 pathway and prevents inflammatory bone destruction［J］. Phytomedicine, 2022, 96: 153838.

［10］Genovese T, Cordaro M, Siracusa R, et al. Molecular and biochemical mechanism of cannabidiol in the management of the inflammatory and oxidative processes associated with endometriosis［J］. Int J Mol Sci, 2022, 23(10): 5427.

［11］Martin L J, Smith S B, Khoutorsky A, et al. Epiregulin and EGFR interactions are involved in pain processing［J］. J Clin Invest, 2017, 127(9): 3353-3366.

［12］Zhu H, Wen B, Xu L, et al. Identification of potential Inflammation-Related genes and key pathways associated with complex regional pain syndrome［J］. Biomolecules, 2023, 13(5): 772.

［13］Rodriguez-Trillo A, Mosquera N, Pena C, et al. Non-canonical WNT5A signaling through RYK contributes to aggressive phenotype of the rheumatoid fibroblast-like synoviocytes［J］. Front Immunol, 2020, 11: 555245.

［14］Jenei V, Sherwood V, Howlin J, et al. A t-butyloxy-carbonyl-modified Wnt5a-derived hexapeptide functions as a potent antagonist of Wnt5a-dependent melanoma cell invasion［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(46): 19473-19478.

［15］Modi A D, Parekh A, Pancholi Y N. Evaluating pain behaviours: widely used mechanical and thermal methods in rodents［J］. Behav Brain Res, 2023, 446: 114417.

［16］Zhu A, Shen L, Xu L, et al. Wnt5a mediates chronic post-thoracotomy pain by regulating non-canonical pathways, nerve regeneration, and inflammation in rats［J］. Cell Signal, 2018, 44: 51-61.

［17］Simonetti M, Kuner R. Spinal Wnt5a plays a key role in spinal dendritic spine remodeling in neuropathic and inflammatory pain models and in the proalgesic effects of peripheral Wnt3a［J］. J Neurosci, 2020, 40(35): 6664-6677.

［18］Ji R R, Xu Z Z, Wang X Y, et al. Matrix metalloprotease regulation of neuropathic pain［J］. Trends Pharmacol Sci, 2009, 30(7): 336-340.

［19］Pan C L, Wang C Y, Zhang L, et al. Procyanidins attenuate neuropathic pain by suppressing matrix metalloproteinase-9/2［J］. J Neuroinflammation, 2018, 15(1): 187.

［20］Shan Y L, Tan S, Lin Y Y, et al. The glucagon-like peptide-1 receptor agonist reduces inflammation and blood-brain barrier breakdown in an astrocyte-dependent manner in experimental stroke［J］. J Neuroinflammation, 2019, 16(1): 242.

［21］Harrington J S, Ryter S W, Plataki M, et al. Mitochondria in health, disease, and aging［J］. Physiol Rev, 2023, 103(4): 2349-2422.

［22］Zeng X, Zhang Y D, Ma R Y, et al. Activated Drp1 regulates p62-mediated autophagic flux and aggravates inflammation in cerebral ischemia-reperfusion via the ROS-RIP1/RIP3-exosome axis［J］. Mil Med Res, 2022, 9(1): 25.

［23］Smart K M, Wand B M, O'Connell N E. Physiotherapy for pain and disability in adults with complex regional pain syndrome (CRPS) types I and II［J］. Cochrane Database Syst Rev, 2016, 2(2): CD010853.

［24］Lloyd E C O, Dempsey B, Romero L. Complex regional pain syndrome［J］. Am Fam Physician, 2021, 104(1): 49-55.

［25］Wang J, Yin C Y, Pan Y S, et al. CXCL13 contributes to chronic pain of a mouse model of CRPS-Ⅰ via CXCR5-mediated NF-κB activation and pro-inflammatory cytokine production in spinal cord dorsal horn［J］. J Neuroinflamma-tion, 2023, 20(1): 109.

［26］Palandi J, Mack J M, De Araújo I L, et al. Animal models of complex regional pain syndrome: a scoping review［J］. Neurosci Biobehav Rev, 2023, 152: 105324.

［27］Huntley G W. Synaptic circuit remodelling by matrix metalloproteinases in health and disease［J］. Nat Rev Neurosci, 2012, 13(11): 743-757.

［28］Page-McCaw A, Ewald A J, Werb Z. Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(3): 221-233.

［29］Wells J M, Gaggar A, Blalock J E. MMP generated matrikines［J］. Matrix Biol, 2015, 44/46: 122-129.

［30］MacLauchlan S, Zuriaga M A, Fuster J J, et al. Genetic deficiency of Wnt5a diminishes disease severity in a murine model of rheumatoid arthritis［J］. Arthritis Res Ther, 2017, 19(1): 166.

［31］Jang J, Jung Y, Kim Y, et al. LPS-induced inflammatory response is suppressed by Wnt inhibitors, Dickkopf-1 and LGK974［J］. Sci Rep, 2017, 7(1): 41612.