内容摘要

 一、NGS检测技术及检测流程

1.第一代测序技术：Sanger测序技术（双脱氧末端终止法）

原理：

ddNTP被加到正在合成的链上，由于它的3-OH已被氧化，下一个dNTP的5-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。

2.第二代测序技术：高通量测序技术

常规流程：

制备好的文库

二、NGS报告复核与解读

生信分析流程主要包括4个步骤：

1、碱基识别

2、序列比对

1）Read比对：和参考基因组比较，将每条read定位在参考基因组上

2）序列排序（sort）：识别比对read的位置，按顺序排列好.Fastq文件中的序列是随机排布的，BWA比对后的结果也未按染色体序号排序。但后续步骤要求bam文件中的序列按染色体位置顺序排列才能进行，所以在此之前需要对bam文件进行排序。

3）去重复：在文库构建过程中DNA打断和PCR过程可能引入变异并通过PCR过程扩大信号导致变异检测结果出现异常。

4）局部重比对：BWA这类在全局搜索最优匹配的算法，在indel区域以及附近区域的对比往往不是很准确，所以需要对潜在和已知的indel区域进行重新校正，重比对后将减低后续变异识别的错误率。

3、变异识别

变异类型：

DNA突变主要检测4种类型：SNV，INDEL，Fusion，CNV

判读标准：

1）SNV/Indel数据查看与复核

SNV/Indel阳性判断标准：

①：VIP突变（0.5%）、1类热点突变（1%）、2类热点突变和非热点突变（3%）、Polymer区域突变（5%）。

②：突变支持reads数（ADP）≥4，且位点的覆盖深度（DP）≥30。

2）基因融合数据查看与复核

阳性判断值：融合突变分热点融合型和非热点融合型，热点融合型的检测阈值为10拷贝，非热点融合型的检测阈值为20拷贝。

3）MSI检测阈值与结果复核标准：

MSI检测需保证样本肿瘤细胞含量≥10%、检测有效深度≥400x。40基因共检测55个微卫星位点，根据位点的串联重复碱基改变分析此位点处于稳定状态或不稳定状态（MSS/MSI）。

4、变异解读

体系突变和胚系突变：

AMP标准：将基因变异分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四类。

Ⅰ类变异：明确临床意义的变异；

Ⅱ类变异：潜在临床意义的变异；

Ⅲ类变异：临床意义未明的变异；

Ⅳ类变异：良性或可能良性变异。

证据等级分为四个等级，A>B>C>D

A级：可用于FDA批准或专业指南中推荐药物治疗的突变；

B级：用于预测药物反应或耐药性的大型临床试验证据或专家共识推荐的突变；

C级：FDA批准用于其他肿瘤的治疗或多个小型临床试验中治疗的突变；

D级：临床前研究或多个个案报道支持，可能具有临床意义的突变。

评级的注意事项

1）注意癌种

例如：EGFR基因21号外显子p.L858R错义突变

如果标本是非小细胞肺癌，该变异为Ⅰ类变异，因为具有明确临床意义

A级：可作为FDA批准治疗某种特异性肿瘤的生物标志物，或被收录于某些特殊类型肿瘤的诊断、治疗、预后评价的权威指南。

如果标本是乳腺癌，该变异为Ⅱ类变异，具有潜在临床意义

C级：在其他癌种中的A级证据、或者已作为临床试验的筛选入组标准、或者有多个小型研究支持。

2）注意顺序

例如，EGFR基因21号外显子p.L858R错义突变

先基因后疾病：L858R对EGFR功能影响——EGFR对肺癌治疗、诊断、预后的影响

高级到低级：A级→B级→C级→D级。

胚系变异解读

参考指南：ACMG指南将变异位点致病性的等级分为致病、疑似致病、临床意义未明、疑似良性和良性5个等级。

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