内容摘要
一、NGS的发展与主流平台介绍
二代测序的应用领域
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无创产前检测
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遗传性肿瘤诊疗
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肿瘤靶向诊疗
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病原微生物检测
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测序技术的迭代发展
二代测序技术主流平台
二代测序的常见术语
Reads数：
测序时每产生一条序列称为一个Read，一次测序完成后产生的所有序列总数即为Reads数。
测序读长：
测序时一次反应所读取的序列长度，如2x150 bp即表示双端各读取150bp长度的序列。DNA文库的插入片段长度必须在读长范围内。
测序通量：
一次测序所产生的数据总量，可理解为（Reads数x读长）。
测序深度：
目标基因组中特定核苷酸被测的次数，可理解为测序得到的数据总量与目标基因组大小的比值。
一、NGS建库测序原理及实验流程
建库三大平台
1、扩增子平台
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针对性强
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可达成千上万重扩增反应同时进行
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操作快速简便
2、杂交捕获平台
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目标区域容量大，通用性强
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可添加UID，灵敏度更高
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满足ctDNA检测需求
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检测流程长，考虑报告周期
流程：
预文库→杂交→捕获→洗涤→扩增捕获文库
3、HANDLE平台
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极简操作，单管完成，<1h手工操作
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可添加UID，特异性出众
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多种变异类型同时检测
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适合临床检测
流程：
主流平台测序原理
1、IlIumina平台测序原理：
碱基互补配对原则：
1、在DNA聚合酶的作用下连接一个带荧光的碱基
2、清除未反应的碱基和酶
3、激发荧光信号并读取
4、去除荧光基团和阻断基团
2、lon Torrent平台测序原理：
乳液PCR：做好的文库，种到测序珠子上进行扩增。
3、ADx-SEQ200Plus测序原理：
DNA纳米球→阵列式流动槽→联合探针锚定聚合技术
三、NGS基于HGVS的基因变异命名规范
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所有变异类型的描述应该基于DNA水平上的改变，RNA或蛋白质水平的改变可以作为补充。
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确认所描述的变异是实验所得还是理论推断所得，如果是理论推断所得要加括号。
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RNA或蛋白质水平的检测结果的描述不能用于反推DNA的改变(描述)，因为转录/翻译方式、简并密码子等问题。
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使用公开且描述清晰的参考序列。
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参考序列使用NCBI或EBI数据库中的ID，必须同时包含accession和version信息。
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如果在NCBI和EBI中没有合适的参考序列，可申请一个LRG编号。
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标记变异所在位置时使用参考序列的首字母缩写。
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变异位置与参考序列文件标识符之间用“：”隔开，例如 NM 000059.3：exon23：c.9085G>A：p.(A3029T)。
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基因组序列(前缀为9.)：位置1指第一个基因组第1个核苷酸(不可使用+、-或其他符号标志)。
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编码DNA(前缀为c.)：位置1指启动密码子ATG中的第一个核苷酸A。
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RNA(前缀为r.)：与编码DNA类似。
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蛋白质(前缀为p.)：位置1指蛋白质第一个氨基酸。
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也适用于单碱基或随机串联重复(氨基酸和核苷酸)。
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所有水平的描述均适用(genome，gene，transcript，protein)
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特例：使用c.，r. or n.描述外显子/外显子连接区域的缺失/重复时不适用。
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DNA-level 123456A>T。
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RNA-level 76a>u。
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protein level Lys76Asn(三字母优先于单字母)。
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国际生化联合命名委员会(NC-IUB)的命名规范。
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当一个变异同时适用重复或插入的变异类型时，根据优先级应描述为重复。
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缺失一部分序列不可再用一部分相同的序列替代。
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间隔一个核苷酸的两个变异，如果影响同一个氨基酸，应描述为“delins”。
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新版的规则将改为：两个变异被少于两个核苷酸隔开时应描述为“delins“。
NGS在临床中的应用
基于扩增子建库的Classic Panel：
适合院内落地的靶向用药NGS检测首选
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一次性检测包括肺癌8个核心基因、NTRK1/2/3等在内的40个靶向用药基因。
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涵盖肺癌、肠癌、胃癌、食管癌、甲状腺癌等20+癌种；涉及已获批或正在临床试验中的70+药物。
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涵盖部分免疫治疗相关基因。
基于HANDLE建库的Classic Panel NGS产品：
简单快速，更易于院内开展
