罕见遗传病的分子诊断难题一直制约精准医疗的推进。RNA测序在近年来作为解读DNA变异对RNA转录影响的有力工具，逐渐进入临床视野。2025年发表在《Genome Medicine》的一项研究由Stark等团队完成，系统评估了RNA测序在53例疑似孟德尔遗传病患者中的临床诊断应用，尤其针对DNA检测发现的候选变异设定猜想驱动的分析情景，同时也对无候选变异患者进行了一次系综式的RNA表达和剪接异常筛查。研究结果不仅提升了多例患者的诊断率，明确变异的致病机制，还发现了多种罕见疾病的新致病基因及分子机制。
DNA测序技术，尤其是全基因组测序（WGS），已成为罕见遗传病诊断的标准，但许多非编码区或剪接位点附近的变异难以仅凭DNA数据准确判定致病性。RNA测序通过揭示变异对转录后产物的影响，能够突破这一瓶颈，对解释难以判定的变异（如非经典剪接位点变异、5'/3'非编码区变异）提供直接分子证据。过去相关研究多基于“RNA优先”方法，即先做RNA-seq发现异常后逆推DNA变异，尚未体现临床常规中DNA先行的诊断流程。此外，RNA-seq对无候选变异患者的诊断价值尚不明确，亟需临床导向的规范评价，以指导其在罕见病诊断路径中的合理应用和医保覆盖。
图1：队列和研究设计
本研究共招募53例遗传病疑似患者，依据既往DNA检测结果分为两组：一组33例含候选DNA变异，主要针对四类变异精准设计RNA-seq分析（非经典剪接位点变异、典型剪接位点变异搭配非典型临床表现、基因内拷贝数变异、调控区与非翻译区变异）；另一组20例为WGS未发现候选变异但临床怀疑度高者，开展假设无偏见的全转录组分析。RNA样本来源依据相关基因的表达水平优先选择临床可获取组织（血液、成纤维细胞、淋巴细胞系、肌肉）。生物信息学流程涵盖RNA质控、双通道STAR比对、剪接异常检测、表达异常分析等，异于GTEx资料库作为对照，进行Z分数计算筛选表达及剪接异常。
主要研究结果
1. RNA-seq在非典型剪接变异中的诊断价值
- 19例含非经典剪接位点变异患者中共21个变异RNA-seq检测成功，68%检测到异常剪接，47%被判定为诊断性异常。剪接异常形式多样，包括外显子跳跃（多为移码）、外显子延伸与部分内含子保留。例如，SASS6基因c.207-11C>A位点变异部分导致第4外显子跳跃，破坏PISA结构域，促发遗传性小头畸形（Case 1）。另一例，NFU1基因非编码变异引发不同转录本比例失衡，导致罕见线粒体病型表现异常（Case 2）。
图2：具有候选推定剪接变体的先证者的 RNA-seq 结果
2. RNA-seq解读典型剪接位点变异对应非典型表型
- 5例典型剪接位点变异患者均检测出剪接异常。部分变异仅在少量转录本中产生异常，解释临床表现轻微或不典型。如EFTUD2基因c.702+1del导致局部（10%以上）外显子剪接变异，患者未显著小头症状（Case 13）。TBX6基因中影响第一编码外显子的剪接变异通过下游启动子产生截短但部分功能保留的蛋白，或许导致先天脊柱侧弯伴非典型表现（Case 14）。
图3：具有经典剪接变异和非典型表型的先证者的 RNA-seq 结果
3. RNA-seq揭示拷贝数变异的转录本机制
- 五例基因内重复，大小从101bp至701kb不等，RNA-seq证实均为串联重复。不同患者中转录本表现不一：COL4A5基因10–24外显子重复产生保持阅读框的异常蛋白，提示蛋白功能部分保留，相关家系肾功能损害轻微（Case 19）；CDKL5基因重复亦维持阅读框，部分内含子保留引发部分转录本降解，或为患者较轻表型提供分子基础（Case 20）。
图4：具有候选拷贝数变异的先证者的 RNA-seq 结果
4. 非编码调控区变异的RNA效应分析
- 5例5’UTR或启动子区域变异（含点突变及CNV）被纳入，RNA-seq检测3例无异常。IDUA基因5’UTR变异c.-87T>C导致表达显著偏倚，野生型等位基因表达受抑制，实验证实启动子活性下降，诊断方案获进一步确证（Case 24）。另一起MAMLD1调控区重复引发基因融合，与通常不表达的BEND2基因融合激活，在成纤维细胞中异常表达，提示潜在致病新模式，虽仍需后续功能验证（Case 28）。
图5：具有候选调节性非编码变异的先证者的 RNA-seq 结果
5. 无候选DNA变异患者的RNA-seq诊断率极低
- 20例WGS未见候选变异患者及15例RNA-seq未诊断候选变异者中，仅1例(3%)发现潜在致病RNA异常，HUWE1基因第67外显子异常跳跃，提示筛查敏感性受限，需辅以强化DNA检测策略。
图6：研究结果总结
总之，本项研究系统验证了RNA测序作为候选DNA变异验证和机制探究的临床辅助工具的重要性，揭示其对非编码及复杂基因结构变异的功能阐释能力显著优于仅DNA检测，为精准诊断提供了分子依据。研究进一步明确了RNA测序在罕见病诊疗流程中的定位：建议优先开展全面DNA测序，本研究推荐的四大变异类型适合后续开展RNA-seq辅助确认。多样的转录本异常形态和致病机制的发现，不仅丰富了人类遗传病的分子病理图谱，也为基因治疗和剪接矫正策略的靶点设计奠定基础。此外，本研究揭示的基因融合事件拓展了孟德尔遗传学遗传机制的理解边界。尽管目前RNA-seq对无候选变异患者的直接诊断效用有限，但其作为辅助验证工具的价值毋庸置疑，未来随着多组学数据整合、长读长RNA测序和组织特异性分析的发展，RNA-seq的临床应用前景将更加广阔。
原始出处:
Stark et al. Clinical applications of and molecular insights from RNA sequencing in a rare disease cohort.Genome Medicine (2025) 17:72. https://doi.org/10.1186/s13073-025-01494-w