【摘要】
目的 探讨冻融单胚胎移植后早期血清β-HCG水平对活产结局的预测价值。
方法 回顾性分析2020年1月至2022年12月于烟台市烟台山医院生殖医学中心行单卵裂期胚胎移植（SCT-D3）后第14天β-HCG（β-HCG14）值及单囊胚移植（SBT-D5/6）后第12天β-HCG（β-HCG12）值均阳性的322个解冻周期患者的临床资料，根据妊娠结局分为生化妊娠组（n=52）、早期流产组（n=47）、活产组3组（n=223），并对女方年龄（＜35岁、≥35岁）行亚组分层。采用二元Logistic回归分析筛选活产相关预测因子，相关及偏相关分析血清β-HCG水平对活产的影响，绘制β-HCG预测活产的受试者工作特征（ROC）曲线并确定阈值。
结果 不同妊娠结局组的早期β-HCG水平差异有统计学意义（H=132.628，P＜0.001），活产组显著高于其他2组（P＜0.001）。二元Logistic回归分析结果显示，女方年龄[OR＝0.460，95%CI(0.248,0.855)，P=0.014]、移植胚胎质量[OR＝2.034，95%CI(1.070,3.868)，P=0.030]、早期β-HCG水平[OR＝1.004，95%CI(1.003,1.005)，P=0.000]是冻融单胚胎移植活产的独立预测因子。ROC曲线分析显示，早期β-HCG预测活产的曲线下面积（AUC）为0.867，敏感度0.937，特异性0.677，临界值为265.5 U/L，并且高龄组预测阈值（341.2 U/L）高于低龄组（240.9 U/L）。
结论 女方年龄、移植胚胎质量、早期β-HCG水平是冻融单胚胎移植活产的独立预测因子；早期β-HCG预测活产ROC曲线在女方不同年龄分层中存在一定差异，但总体预测价值较高，各中心可定义自身活产预测期望值。
无论是自然妊娠还是通过辅助生殖技术（ART）获得的妊娠，血清β-HCG水平都是预测妊娠结局的关键指标。移植后早期低水平β-HCG往往预示着不良妊娠结局（生化妊娠、异位妊娠、流产等）风险。既往已有研究表明，高龄（≥35岁）是影响体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗结局的独立危险因素，但是否对早期β-HCG水平产生影响尚无定论。由于妊娠活产受多因素影响，加之个体间早期β-HCG水平异质性较大，预测活产的临界值尚无明确标准，且针对不同年龄分层的β-HCG活产预测研究较少。
为避免移植胚胎数、移植方式、检测时机对β-HCG水平的影响，本研究作为一项回顾性队列研究，通过分析冻融单胚胎移植患者的周期数据，以冻融单卵裂期胚胎移植（SCT-D3）后第14天β-HCG（β-HCG14）及冻融单囊胚移植（SBT-D5/6）后第12天β-HCG（β-HCG12）检测结果为依据，在阳性患者中分析不同妊娠结局的β-HCG水平差异及其对活产的影响，确定预测活产的β-HCG阈值范围，以缓解患者移植后的压力和焦虑，为后续诊疗提供参考标准。
资料与方法
一、研究对象及分组
回顾性分析2020年1月至2022年12月在烟台市烟台山医院生殖医学中心行IVF/ICSI冻融单胚胎移植的周期数据。纳入标准：（1）本院行IVF/ICSI治疗患者；（2）行选择性冻融单胚胎移植者；（3）SCT-D3后β-HCG14及SBT-D5/6后β-HCG12检测阳性（β-HCG≥7 U/L）。排除标准：（1）行胚胎植入前遗传学检测（PGT）或供精、供卵、卵子冷冻复苏周期；（2）单卵双胎及异位妊娠者；（3）冻融胚胎移植（FET）后第12/14天之前或之后检测血清β-HCG及外院检测者；（4）复发性流产或存在影响胚胎发育的宫腔病变或畸形者；（5）存在宫颈机能不全、染色体异常等导致晚期流产及死胎者。
根据纳排标准共纳入285例患者的322个FET周期，根据妊娠结局分为生化妊娠组（n=52）、早期流产组（n=47）、活产组（n=223）；并根据女方年龄（＜35岁和≥35岁）进行亚组分层。本研究通过烟台市烟台山医院医学伦理委员会审批（伦理号：烟山伦准2024024号）。
二、研究方法
1.内膜准备方案：（1）月经规律者采用自然周期方案（NC）准备内膜，于月经周期第8～10天B超监测卵泡发育及内膜情况，排卵日开始给予地屈孕酮片（10 mg/片，雅培，荷兰）40 mg/d分2次口服，转化内膜。D3卵裂期胚胎于排卵后3 d行FET，D5/D6囊胚期胚胎于排卵后5 d行FET。（2）对月经不规律、无排卵或排卵障碍者选用激素替代周期（HRT）恒量方案，于月经周期第2～3天给予芬吗通（2 mg/2 mg:10 mg/片，雅培，荷兰）4～8 mg/d，口服14 d行B超检查，如子宫内膜厚度≥8 mm加地屈孕酮片转化内膜，方法及移植胚胎日期同自然周期。
2.胚胎评分标准：卵裂期胚胎评分参考Istanbul共识，囊胚期胚胎评分参考Gardner评分法，由2位资深胚胎学专家进行评分，保留图像备质控。D3优质胚胎为7～9细胞、评级为I和Ⅱ；D5评分≥3BB、D6评分≥4BB为优质囊胚。本中心可利用囊胚为Gardner评分≥3BC和≥3CB的囊胚。
3.β-HCG水平测定：D3单卵裂期胚胎在移植后第14天（SCT-D3后β-HCG14）、D5/6单囊胚期胚胎在移植后第12天（SBT-D5/6后β-HCG12），晨起抽取空腹静脉血，采用电化学发光免疫分析仪（cobas e 602，罗氏，德国）进行测定，变异系数范围为4.0%~6.5%，血清β-HCG≥7 U/L为阳性。
4.妊娠结局判断：排除异位妊娠、单卵双胎、晚期流产后，妊娠结局分为生化妊娠、早期流产、活产。其中移植后早期β-HCG≥7 U/L，后期下降，移植后4周经阴道超声未探及孕囊者诊断为生化妊娠；移植后4周阴道超声探及孕囊者为临床妊娠；早期流产为确认临床妊娠后，孕12周内超声诊断为非临床活胎妊娠者；活产为获得孕28周以上活产胎儿。
5.观察指标：主要包括一般资料、移植胚胎参数、早期β-HCG水平等。
三、统计学分析
采用SPSSAU在线分析软件对数据进行分析。正态分布数据以均值±标准差（x±S）表示，多组间比较采用方差分析；非正态分布数据以中位数（四分位间距）[M（P25，P75）]表示，两组间比较采用MannWhitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，事后多重比较采用Scheffe法；分类数据采用例数（n）、构成比(%)表示，组间比较采用χ2检验和Bonferroni校正多重比较；二元Logistic回归分析筛选活产的独立预测因子，并行分层卡方、偏相关分析验证；采用python 3.11.7构建冻融单胚胎移植β-HCG预测活产的受试者工作特征（ROC）曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、不同妊娠结局患者的基本资料
本研究共纳入322个冻融单胚胎移植后早期β-HCG阳性（β-HCG12/14≥7 U/L）周期进行分析，其中非活产（生化妊娠和早期流产）99例，活产223例。单因素方差分析显示，3组患者女方年龄、抗苗勒管激素（AMH）、移植胚胎类型、胚胎质量、早期β-HCG水平差异均有统计学意义（P＜0.05）；不孕年限、不孕类型、体质量指数（BMI）、基础FSH（bFSH）、基础LH（bLH）、基础E2（bE2）、胚胎授精方式[IVF、ICSI及R-ICSI（补救ICSI）]、移植日内膜厚度差异均无统计学意义（P＞0.05）。
Bonferroni校正多重比较发现，活产组女方高龄（≥35岁）占比显著小于生化妊娠组和早期流产组（P＜0.05），生化妊娠组与早期流产组高龄占比差异无统计学意义（P＞0.05）；3组患者AMH两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。3组间移植胚胎类型以卵裂期、囊胚期分层分析，差异无统计学意义（χ2=5.756，P=0.056）；以胚胎发育天数分层（D3、D5、D6），差异有统计学意义（χ2=23.834，P＜0.001）；多重比较显示，活产组D6胚胎占比显著低于其他2组（P＜0.001）。胚胎质量多重比较显示，活产组优胚占比显著大于其他2组（P＜0.05），而生化妊娠与早期流产组差异无统计学意义（P＞0.05）。3组间早期β-HCG水平差异有统计学意义（H=132.628，P＜0.001），事后检验Scheffe校正分析显示：活产组显著大于其他2组（P＜0.001），早期流产组显著大于生化妊娠组（P＜0.01）（表1）。
（表1）
二、活产影响因素分析
1.活产影响因素回归分析：以是否活产作为因变量（否=0，是=1），将单因素分析中差异有统计学意义的变量，包括女方年龄（＜35岁=0，≥35岁=1）、AMH水平、移植胚胎发育天数（D3=0、D5=1、D6=2）、移植胚胎质量（非优胚=0，优胚=1）、血清β-HCG水平作为自变量，进行二元Logistic回归分析，结果显示：女方高龄对活产结局呈显著负向影响，移植胚胎质量、血清β-HCG水平对活产结局呈显著正向影响（表2）。
（表2）
2.不同年龄、胚胎质量对活产结局的影响：对女方年龄、移植胚胎质量进行分层卡方检验（过程及汇总数据详见表3、表4），结果显示：控制干扰因素（胚胎质量）后，条件独立性检验呈现显著性（chi=9.947，P=0.002），女方年龄（＜35岁和≥35岁）与活产结局之间呈现显著性差异，合并OR值为0.443[95%CI（0.269，0.728）]；控制干扰因素（年龄）后，条件独立性检验呈现显著性（chi=13.326，P＜0.001），移植胚胎质量和活产结局之间呈现显著性差异，合并OR值为2.631[95%CI（1.570，4.406）]。
（表2，表3）
3.血清β-HCG水平与妊娠结局的相关性分析：Spearman相关性分析显示，血清β-HCG水平与妊娠结局的相关系数值为0.625（P＜0.01）。为剔除混杂因素（年龄、胚胎质量）干扰，偏相关分析显示，胚胎质量是控制变量，年龄未对β-HCG水平产生影响，β-HCG水平与妊娠结局的相关系数值为0.540，呈中等强度正相关（P＜0.01）。活产回归分析中β-HCG水平对活产结局产生显著正向影响（OR值为1.004，P＜0.01）。
三、预测活产的早期β-HCG临界值
构建早期血清β-HCG预测活产ROC曲线，将非活产（生化妊娠和早期流产）与活产组数据分析，预测活产Cut-off值为265.5 U/L；对女方年龄分层分析，＜35岁为240.9 U/L，≥35岁为341.2 U/L（表5、图1）。
（表5）
排除生化妊娠，针对早期流产及活产组数据分析，预测活产Cut-off值为612.0 U/L；＜35岁为612.0 U/L，≥35岁为341.2 U/L（表5、图2）。
（图1，图2）
讨 论
一、活产相关预测因子的影响机制
不同妊娠结局单因素分析中，女方年龄、AMH、移植胚胎、胚胎质量及早期β-HCG水平差异均有统计学意义；活产回归分析，女方年龄、胚胎质量、早期β-HCG水平是其独立预测因子。女方年龄是ART技术首先要考虑的重要因素。本研究结果显示，女方高龄与活产结局呈负相关。分析其原因，随着年龄增加患者卵巢储备功能下降，卵母细胞质量降低，染色体非整倍性增加，卵母细胞线粒体数量减少，导致低植入率、高流产率等不良妊娠结局风险增加。AMH水平在妊娠结局单因素分析中差异有统计学意义，但在多重比较及活产回归分析中未呈现出显著性。AMH是反应女性卵巢储备功能的标志物，主要由卵泡颗粒细胞合成，调控卵泡发育并与卵母细胞成熟率、胚胎质量有一定关系。为验证是否影响妊娠结局，采用偏相关分析控制混杂变量（女方年龄、移植胚胎类型、胚胎质量、早期β-HCG水平）后，AMH与妊娠结局仍不相关（rs=0.027，P=0.635）。由于AMH水平的异质性，FET妊娠后未能建立活产区分阈值，可考虑AMH水平作为ART助孕咨询的参考指标。
国内外关于FET中卵裂期胚胎或囊胚移植后妊娠结局的研究结果不尽相同。部分研究显示，二者持续妊娠率、活产率、围产期结局无明显差异；也有学者认为，囊胚移植的临床妊娠率、活产率显著高于卵裂期胚胎移植，而不良妊娠及围产期结局无明显差异。本次研究显示，如以卵裂期胚胎、囊胚分层分析，妊娠结局差异均无统计学意义；如以D3、D5、D6分层分析，差异有统计学意义，考虑其妊娠结局差异可能源于所移植D5、D6胚胎比例的差异，多重比较活产组SBT-D6胚胎比例显著低于其他两组。已有研究表明，SBT-D5临床妊娠率高于SBT-D6，早期流产率低于SBT-D6，与本研究结果一致。关于移植D5和D6囊胚对妊娠结局影响的机制尚存有争议。本研究卡方检验结果显示，SBT-D6中优胚率低（χ2=18.960，P＜0.01），考虑D6囊胚发育较D5囊胚有所迟滞，在胚胎质量方面较差；也可能是冷冻复苏过程中的DNA损伤等原因导致了SBT-D6早期流产率增高。
移植胚胎质量与妊娠结局呈正相关，活产组优胚移植率大于其他两组。Savio Figueira Rde等通过植入前遗传非整倍体筛查(PGS)研究发现，高质量囊胚较低质量囊胚染色体整倍性高，有利于胚胎着床并降低流产风险。虽然非优质胚胎活产率较低，但仍有其应用价值。在围产期随访发现，胚胎质量对妊娠并发症、新生儿体重、身长、出生缺陷等均无显著影响。原因可能与子宫内膜可对不同质量的胚胎通过调节信号通路、细胞因子分泌，改变子宫微环境，促进胎儿生长发育有关，但其确切机制仍待进一步研究。
二、早期血清β-HCG水平与妊娠结局的相关性
β-HCG是由胚胎合体滋养层细胞合成、分泌的一种糖蛋白激素，妊娠早期HCG可从子宫内膜容受性、免疫等方面调控胚胎植入过程和维持妊娠状态，有助于胚胎着床和胎盘发育。高水平的β-HCG可预示更好的持续妊娠和活产率。由于血清β-HCG水平的时效差异，本中心根据移植胚胎类型选择不同检测时间节点（胚胎发育的等效天数），以构建精准的比较基础。在β-HCG水平与妊娠结局的相关及回归分析中，胚胎质量作为干扰项对β-HCG水平和妊娠结局均呈显著正相关，排除混杂干扰后β-HCG与活产结局仍呈中等强度正相关。对于HCG阳性者其分泌活性可能表达了胚胎发育的潜能，而基于形态学参数评定的优质胚胎，或可影响滋养层细胞分泌HCG的量，胚胎细胞数量增加的同时，对滋养层的修复能力上升，HCG的分泌更早更快。在已初步种植的患者中女方年龄未对β-HCG水平产生显著影响，但随年龄增加β-HCG水平有降低趋势，并与活产结局相关。这与既往研究的结论相似，因此引发了我们的思考，β-HCG是否作为调节变量，在女方年龄、胚胎质量对妊娠结局的影响中发挥交互效应？但确切结论尚需更大样本量的研究深入探索，这也是我们后续的研究方向。
三、早期β-HCG预测活产的阈值参考
尽管血清β⁃HCG水平预测妊娠结局的意义已被证实，但其临界值既无明确标准，也并非普遍适用。对于纳入研究的冻融单胚胎移植后早期β⁃HCG阳性的患者，已初步确认妊娠，故此类患者对活婴出生期望更高，对血清β⁃HCG检测结果更感焦虑，希望通过β⁃HCG值预测活产率。现阶段确定适用于本中心的β⁃HCG预测活产临界值为患者后续诊疗提供数据参考，具有实践指导意义。
Qiu等研究发现，在单囊胚FET后第10天的血清β-HCG活产阈值为146.37 U/L；王涛等发现，FET后第14天β-HCG活产阈值为198.91 U/L；另有报道单囊胚FET后第12天β-HCG活产阈值为657.5 U/L。预测值变异较大，考虑其原因除测量时机不同外，还可能与纳入标准、分析方法的差异性相关，即生化妊娠标准不同以及状态变量数据范围不尽相同。对此各中心可根据临床需求灵活运用，如想提高活产预测敏感度，减轻患者心理压力、提高活产信心，则可将生化妊娠、早期流产数据设为非活产组与活产组数据分析，此时β-HCG预测阈值为265.5 U/L，敏感度0.937，特异性0.677；如果想提高活产预测特异性，尽可能筛选出早期流产高风险人群，可排除生化妊娠数据，针对早期流产与活产数据进行ROC分析，此时β-HCG预测阈值为612.0 U/L，敏感度0.623，特异性0.787。对于β-HCG＜265.5 U/L的患者，活产机率较低（17.28%），即使动态监测β-HCG翻倍指标尚可，结合高龄、移植胚胎参数（非优质）等情况，后期胚胎停育风险仍较高，医护人员应做好患者心理建设，综合评估保胎治疗价值，建议在FET后的早期阶段进行观察而非干预，把不良妊娠对母体的损伤降至最低。对于β-HCG＞612.0 U/L的患者，活产机率大（92.05%），在移植后12/14 d即可以轻松心态迎接新生命到来，不必过分忧虑非优胚可能导致不良妊娠结局，可以显著缩短患者及家庭压力时间。β-HCG介于265.5～612.0 U/L的患者不可忽视流产风险（20.00%），医护人员应密切关注流产征兆，及早干预性治疗，采取积极措施维持继续妊娠。虽然年龄未对β-HCG水平产生显著影响，但随年龄增加β-HCG水平有降低趋势。不同年龄分层构建的ROC曲线显示，女方≥35岁在上述2种状态变量分析中β-HCG活产预测值均为341.2 U/L。考虑这可能与高龄组病例较少，β-HCG变异范围较大，高龄组ROC曲线最佳界值对应同一临界点有关，但确切结论尚待多中心、大样本的深入研究。
本研究评估了FET单胚胎移植后早期血清β-HCG水平对活产的预测价值。结果显示，女方年龄、移植胚胎质量、早期β-HCG水平是冻融单胚胎移植活产的独立预测因子；单胎活产早期β-HCG预测阈值为265.5 U/L，且在女方不同年龄分层中存在一定差异，但总体预测价值较高，各中心可定义自身β-HCG活产期望值，为FET后的临床决策提供数据参考。本研究的局限性在于：作为单中心回顾性研究，样本量偏少，可能存在选择和信息偏倚，同时妊娠活产是一个持续变化的过程，活产还受内分泌、环境、情绪等多因素影响，今后可开展多中心联合的前瞻性大样本研究，并通过代谢组学和转录组学层面的分析进一步明确不同年龄分层的早期β-HCG水平对活产的影响。
文章来源：张爱玉，王冬梅，王惠，等.冻融单胚胎移植后早期血清β-HCG水平对活产结局的预测价值[J].生殖医学杂志，2024,33(11):1415-1422.