病毒性呼吸道感染是世界范围内发病率和死亡率的常见原因。由于不同呼吸道病原体的临床表现相似，qPCR等分子检测方法仍然具有重要的诊断和流行病学价值。多重qPCR被广泛用于在一次检测中检测多种呼吸道病原体，然而，由于荧光基团的潜在重叠以及引物探针组之间的相互作用，每个孔的目标数量受到限制。微流控qPCR可以将纳升样品和反应成分导入多个单一反应微室进行扩增和检测，从而克服这些问题。与实时qPCR相比，使用微流控qPCR的好处包括每次运行的目标数量增加，热循环速度加快，污染减少，样品和试剂体积大幅减少。

近日，杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Microfluidic qPCR for detection of 21 common respiratory viruses in children with influenza-like illness”的文章。作者使用市售的微流控qPCR系统建立了一个21种呼吸道病毒的微流控qPCR panel，以检测从冈比亚儿童收集的上呼吸道拭子中常见的呼吸道病毒。结果显示，76.6%的样本检出一种或多种病毒，检出最多的为鼻病毒和腺病毒。数据表明，微流控qPCR是监测平台上高通量、全面检测多种呼吸道病毒的有用工具。

图片来源：Scientific reports

主要内容

微流控qPCR检测概述

微流控qPCR检测中使用的呼吸道病毒引物探针包括腺病毒、人偏肺病毒（HMPV） A、HMPV-B、甲流、乙流、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、鼻病毒、RSV-A、RSV-B和季节性冠状病毒（229E，NL63，OC43）、季节性冠状病毒HKU1、人博卡病毒1、人博卡病毒2-4和严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2) RdRP、E和N。

执行微流体qPCR是来自Standard BioTools™（原Fluidigm）的Juno™和Biomark™系统。作者使用192.24 Dynamic Array™IFC进行qPCR，该IFC有192个样品池和24个测定池，可在单个IFC上进行4608个单独的qPCR反应（如下图）。

样品处理和微流控分析示意图。图片来源：Scientific reports

微流控试验验证

78例核酸提取物用于微流控测定验证。实验室PCR结果显示，其中65例至少有一种病毒阳性（83.3%），其中5例至少有两种病毒阳性。阳性结果包括鼻病毒（23例）、SARS-CoV-2（19例）、RSV（11例）、腺病毒（8例）、甲型流感（6例）、季节性冠状病毒（2例）和副流感（1例）。与实验室PCR结果比较，微流控测试中大多数靶标都得到了正确的结果（如下表）。

STH样品微流控检测验证结果。图片来源：Scientific reports

实验室和微流控PCR结果的一致性分析

对实验室和微流控PCR结果进行一致性统计分析，结果显示SARS CoV-2 RdRP、SARS CoV-2 E、RSV和鼻病毒一致性较高，具有较高的可信度。腺病毒虽然在可接受的信度范围内，但可信度最低（如下图）。

微流体与实验室PCR的相关性研究。

图片来源：Scientific reports

微流控qPCR

在流感样疾病患儿呼吸道病毒检测中的应用

作者从出现ILI症状（发烧、咳嗽或喉咙痛）的冈比亚儿童中收集了158份上呼吸道拭子。大多数样本至少检出一种病毒（n = 121/158, 76.6%）。鼻病毒和腺病毒是检测频率最高的病毒。近三分之一的阳性样本检测到多种病毒(2种病毒n = 31/121；三种病毒n = 9/121)。最常见的共感染发生在两种最常检测到的病毒鼻病毒和腺病毒之间（n = 11/40）。

对每个月检测到的每种呼吸道病毒导致的ILI患儿人数进行了分析。腺病毒的检测高峰在4 - 5月，鼻病毒在3月。HMPV-A和流感病毒在雨季最常被发现。其他病毒似乎没有一致的季节性模式（如下图）。

微流控qPCR在呼吸道病毒检测中的应用。

图片来源：Scientific reports

总结与讨论

在冈比亚出现ILI的幼儿队列中，作者成功地应用了微流控qPCR技术，揭示了许多值得注意的发现，包括除鼻病毒感染外腺病毒的高频率，以及ILI患儿上呼吸道拭子中多种病毒的高检出率。在ILI/SARI患者中检测广泛的呼吸道病毒的强有力的全球监测规划对于大流行的防范至关重要。要用作监测分析，这种高通量分析的运行成本低，手动处理时间短。且使用微流体qPCR的一个特别优势是避免了引物探针交叉反应性的问题。