肌腱结合部（MTJ）损伤在临床实践中很常见，但治疗方法仅限于外科缝合和保守治疗，且复发率高。目前关于MTJ组织工程的研究较少，且缺乏对修复效果的体内评估。在这里，南京医科大学姚庆强、东南大学张薇/陈佳林开发了一种含有间充质干细胞（MSCs）和Klotho的三维打印生物活性纤维增强水凝胶，用于结构性和功能性MTJ再生。在大鼠MTJ缺陷模型中，生物活性纤维增强水凝胶促进了肌肉、肌腱和肌肉-肌腱界面的结构恢复，并增强了受损MTJ的功能恢复。体内蛋白质组学和体外细胞培养阐明了生物活性纤维增强水凝胶通过调节氧化应激和炎症来调节修复机制，从而工程化一个优化的微环境，以支持移植的MSCs的存活和分化，并维持MTJ组织内驻留细胞（包括肌腱/肌肉细胞和巨噬细胞）的功能表型。这一策略为MTJ损伤的治疗提供了一个有希望的方案。该研究以题为“Bioactive fiber-reinforced hydrogel to tailor cell microenvironment for structural and functional regeneration of myotendinous junction”的论文发表在《Science Advances》上。
图1展示了生物活性纤维增强水凝胶的制备和特性。研究者利用熔融沉积建模（FDM）3D打印技术制造了具有正交排列网格和互联宏孔的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架，以提供机械和结构支持。随后，将丝素蛋白甲酯化物（SilMA）前体、间充质干细胞（MSCs）和重组Klotho蛋白融合到PLGA支架中，并通过光交联形成具有微孔和互联结构的纤维增强水凝胶。扫描电子显微镜（SEM）图像显示了微孔SilMA水凝胶在宏观孔PLGA支架间隙中的渗透，为细胞粘附提供了优化的微环境。
图 1.生物活性纤维增强水凝胶的制备和表征
【生物活性纤维增强水凝胶有效增强大鼠MTJ的结构和功能再生】
通过苏木精-伊红(H&E)染色和Masson三色染色，观察到M@SM-PA和K/M@SM-PA组再生的MTJ组织中肌肉和肌腱纤维的广泛插入和明显的交错，而对照组和SM-PA组则显示出较少、不规则和短的交错。此外，与对照组和SM-PA组相比，K/M@SM-PA组诱导形成了更有组织的肌腱纤维。定量分析显示，K/M@SM-PA组的肌腱组织形态学评分显著降低，表明其形成了更类似于肌腱的组织。在再生的肌肉组织中，K/M@SM-PA组的肌肉纤维直径显著增加，表明K/M@SM-PA水凝胶促进了肌肉再生。此外，肌腱标记物tenomodulin (TNMD)和肌肉标记物myosin heavy chain 4 (MYH4)的表达水平也在新形成的组织中进行了评估，K/M@SM-PA组在TNMD和MYH4表达上均显著高于其他组。这些结果共同表明，K/M@SM-PA水凝胶有效地促进了受损MTJ的结构再生，并可能通过改善肌肉-肌腱界面的整合和成熟肌腱组织的形成来实现。
图 2.生物活性纤维增强水凝胶增强大鼠MTJ的结构再生
通过步态分析，评估了手术后不同时间点大鼠的步态参数，包括步幅长度、摆动时间和摆动速度等。结果显示，所有手术组在术后1周都出现了步态异常，但随着时间的推移，这些参数逐渐恢复，K/M@SM-PA组的恢复最为显著。特别是，在术后2周时，K/M@SM-PA组的步幅长度和摆动速度显著高于对照组，且摆动速度超过了正常大鼠的水平。此外，K/M@SM-PA组在术后4周的强度参数上表现出最高水平，表明了更稳定的站立姿势和减少的疼痛。这些步态分析结果表明，生物活性纤维增强水凝胶显著改善了MTJ的功能恢复。
图 3.生物活性纤维增强水凝胶可促进大鼠MTJ的功能恢复
【体内蛋白质组学揭示了生物活性纤维增强水凝胶促进MTJ再生的潜在机制】
通过比较M@SM-PA和K/M@SM-PA两组再生MTJ组织中的蛋白质表达差异，研究者们鉴定了193个上调的差异表达蛋白(DEPs)和553个下调的DEPs。基因本体(GO)富集分析显示，上调的DEPs与肌肉系统过程、骨骼肌收缩、肌肉结构发展和骨骼肌组织发展等生物学过程有关，而下调的DEPs与氧化应激反应、炎症反应和细胞死亡等过程有关。这些结果表明，K/M@SM-PA水凝胶通过调节氧化应激和炎症反应，改善了细胞微环境，从而促进了MTJ的再生。此外，K/M@SM-PA水凝胶还通过促进肌肉细胞的发育和分化，维持了细胞的生存，并且通过引导巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型转变，进一步促进了MTJ的再生。
图 4.体内全球蛋白质组学揭示了生物活性纤维增强水凝胶促进MTJ再生的潜在机制
【生物活性纤维增强水凝胶可促进细胞存活并支持移植间充质干细胞的生肌分化】
图5通过体外实验评估了含Klotho的生物活性纤维增强水凝胶对MSCs在H2O2和IL-1β诱导的氧化应激和炎症环境下的保护作用。结果显示，与未处理的MSCs相比，经H2O2或IL-1β处理的MSCs在没有水凝胶保护的情况下，活性氧(ROS)阳性细胞比例显著增加，表明氧化应激水平升高。而Klotho加载的水凝胶显著降低了ROS阳性细胞的比例，并提高了抗氧化酶如超氧化物歧化酶1、锰依赖性超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的表达水平，从而有效清除了病理环境中的ROS。此外，Klotho水凝胶处理的MSCs在H2O2诱导的细胞死亡中显示出更高的细胞存活率。在体内实验中，Klotho水凝胶处理组在MTJ缺陷区域移植后7天的Dil阳性MSCs数量也显著高于未处理组，证实了Klotho水凝胶对移植MSCs存活的促进作用。在评估MSCs的分化能力时，Klotho水凝胶在生长和分化培养基中均支持MSCs向肌腱和肌肉细胞的分化，并在IL-1β刺激下部分恢复了MSCs的分化能力，表明Klotho水凝胶在病理微环境下仍能保护MSCs的肌腱和肌肉分化潜能。因此，Klotho加载的生物活性纤维增强水凝胶通过其抗氧化和免疫调节特性，有效提高了MSCs的存活率，并支持了它们的肌腱和肌肉分化，这可能有助于MTJ的修复和再生。
图 5.生物活性纤维增强水凝胶通过抑制氧化应激来提高细胞存活率并支持间充质干细胞的分化
【生物活性纤维增强水凝胶通过抑制氧化应激来维持成肌细胞和肌腱干细胞的表型】
C2C12细胞和TSPCs经H2O2和IL-1β处理以模拟受伤MTJ的病理环境，通过DCFH-DA荧光探针检测发现，与对照组相比，经H2O2/IL-1β处理的细胞在没有水凝胶保护时表现出更高的活性氧(ROS)阳性率，而Klotho加载的水凝胶显著降低了这两种细胞类型的ROS阳性率。此外，IL-1β处理导致C2C12细胞的肌细胞表型标志物PAX-7和TNNT1的表达下降，而Klotho水凝胶能够部分恢复这些标志物的表达。免疫荧光(IF)染色也显示，IL-1β刺激下C2C12细胞的肌细胞标志物MYH4、MYOD1和Myogenin的蛋白表达受到抑制，而Klotho水凝胶能够缓解这种抑制效应。对于TSPCs，IL-1β处理抑制了腱细胞标志物TNMD和SCX的蛋白表达，Klotho水凝胶同样能够减轻这种抑制作用。这些结果表明，Klotho加载的生物活性纤维增强水凝胶通过降低氧化应激，维持了C2C12细胞和TSPCs的功能性表型，可能促进了体内肌肉、肌腱及肌肉-肌腱连接处的再生。
图 6.生物活性纤维增强水凝胶通过抑制氧化应激来维持 C2C12 和 TSPC 的功能表型
【生物活性纤维增强水凝胶引导巨噬细胞从促炎表型到抗炎表型的极化】
图7展示了生物活性纤维增强水凝胶对巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型转变的引导作用。实验中，RAW 264.7巨噬细胞系经脂多糖(LPS)刺激以诱导M1极化，通过免疫荧光(IF)染色观察到，与对照组相比，LPS刺激显著增加了M1标记物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，而M2标记物CD206和精氨酸酶-1(ARG-1)的表达则显著降低，证实了LPS诱导的M1极化。然而，在Klotho加载的水凝胶处理下，iNOS的蛋白表达显著降低，而CD206和ARG-1的蛋白表达显著提高，表明该水凝胶具有将巨噬细胞从M1向M2表型转变的能力。体内实验中，通过免疫组化(IHC)染色评估了植入K/M@SM-PA水凝胶后7天修复的MTJ样本中的iNOS、CD206和ARG-1的表达，结果进一步证实了Klotho水凝胶在体内促进巨噬细胞M2极化的作用。这些发现表明，Klotho加载的生物活性纤维增强水凝胶通过调节巨噬细胞的极化状态，减少了炎症反应，可能有助于减轻MTJ损伤后的病理纤维化和瘢痕形成，从而促进了腱样组织的再生。
图 7.生物活性纤维增强水凝胶引导巨噬细胞极化从 M1 到 M2 表型
图8阐释了该水凝胶系统不仅提供了足够的机械强度以维持MTJ的生理功能，而且还通过其抗氧化和免疫调节活性优化了细胞微环境，从而促进了受损MTJ的结构和功能再生。具体而言，该水凝胶通过三维打印的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)支架提供了与天然MTJ相近的力学性能，支持肌肉-肌腱界面的力量传递。同时，通过在水凝胶中加入Klotho蛋白，减轻了氧化应激和炎症反应，为移植的间充质干细胞(MSCs)的存活和分化以及维持腱/肌肉细胞和巨噬细胞等内源性细胞的功能表型创造了有利的微环境。此外，该水凝胶还通过引导巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型转变，进一步促进了MTJ的再生过程。
图 8.生物活性纤维增强水凝胶促进MTJ再生的示意图
【小结】
该研究通过开发一种新型的生物活性纤维增强水凝胶，能够有效促进肌腱-肌肉连接处（MTJ）的结构和功能再生。该水凝胶系统结合了三维打印的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架的机械强度和Klotho蛋白的抗氧化及免疫调节特性，为受损MTJ的修复提供了优化的微环境。研究表明，该水凝胶能够显著提高MSCs的存活率，支持其在病理环境下的肌腱和肌肉分化能力，并维持了C2C12肌细胞和腱干细胞（TSPCs）的功能性表型。此外，该水凝胶还能够调节巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型的转变，减少炎症反应，并促进了腱样组织的再生。通过体内外实验的综合评估，论文证实了该生物活性纤维增强水凝胶在MTJ损伤治疗中的潜力，为临床治疗提供了新的策略。
原文链接：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adm7164