摘要:脑侧支血管生成发生在缺血性卒中的各个时期,是指脑缺血区血管内皮细胞经过基膜降解､活化､增殖及迁移等活动,在现存血管的基础上形成微血管网的病理过程｡缺血性卒中后,血管网的形成能够有效恢复组织血流灌注,缓解神经功能缺损症状及改善预后｡作者从细胞信号传导的角度出发,对缺血性卒中侧支血管生成的机制及其新兴的治疗性干预途径进行了综述｡

卒中是全球最主要的致死性疾病之一,也是目前中国第一位的死亡病因｡其中,脑动脉狭窄或栓塞引起的卒中是最常见的卒中类型,其因快速且不可逆的缺血缺氧性组织坏死而产生严重的神经功能缺损症状｡脑血运重建是缺血性卒中的首要治疗目标,但其治疗方法非常有限,针对责任血管的药物溶栓或介入治疗虽有实现血管再通的可能,但因治疗时间窗短､再通成功率不高等原因而只能使部分卒中患者获益｡因此,促进梗死周围区的脑侧支血管生成,间接恢复缺血区血流,对于缺血性卒中的治疗及预后意义重大｡

1 脑缺血与侧支血管生成

缺血性卒中后机体启动代偿保护机制,利用侧支循环恢复缺血区血流｡其中,初级代偿通路是连接大脑前后血流的大脑底部吻合动脉环——Willis环,而大脑动脉皮质支在软脑膜内形成的血管网与连接颈内､外动脉的眼动脉组成次级代偿通路共同发挥作用｡当这两条代偿途径受到先天发育及后天致病因素的影响,缺乏足够的代偿能力时,新生血管就成为了最后的代偿途径｡研究表明,梗死周围区的微血管密度,与卒中患者的存活时间延长相关｡脑侧支血管生成是在供血动脉闭塞或严重狭窄条件下,由脑缺血区现存血管萌生或者分裂而形成新的微血管网的过程,除多种血管生长因子直接诱导的血管内皮反应外,还包含基底膜的降解､血管网的剪切以及血管周围基质细胞(周细胞)的支持稳定等多种复杂的生理､病理活动｡侧支血管生成不仅是病理条件下新血管生成的始动环节,也是多种细胞信号通路共同调控的核心阶段｡

2 脑侧支血管生成相关信号通路

2. 1 血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF) - 血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)通路

VEGF因其对血管内皮细胞具有高度特异性的促有丝分裂作用,目前被认为是最关键的血管生成介导因子｡多种VEGF配体中,VEGFA在脑血管生成过程中发挥作用｡VEGFR 根据是否具有酪氨酸激酶活性分为VEGFR-1､VEGFR-2､VEGFR-3以及神经纤毛蛋白1､神经纤毛蛋白2｡当脑组织缺血缺氧发生后,低氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor1,HIF-1)首先激活 VEGF-VEGFR 通路,VEGF与其酪氨酸激酶受体VEGFR-2相结合,通过调节细胞内的酪氨酸激酶反应,诱导一系列生理､病理活动,包括改变血管内皮细胞的功能状态,促进其增殖､迁移;刺激前列环素和一氧化氮(nitric oxide,NO)的产生,舒张血管,增加血管通透性;通过趋化作用使巨噬细胞聚集并进一步分泌VEGF等细胞因子;增加基质金属蛋白酶(MMP)的生成,分解细胞外基质以及抑制血管内皮细胞的凋亡等｡VEGFR-1与VEGF亲和力高,但酪氨酸激酶活性低,因此可以竞争性抑制VEGF与VEGFR-2的结合,负性调控血管的生成。

研究显示,在小鼠大脑中动脉闭塞(middlecerebral artery occlusion, MCAO)1 d后,VEGFR-1､VEGFR-2在梗死周围区表达均增加,3 d 后水平最高,7 d后逐渐恢复正常;而VEGF的表达水平较上述两种受体更早发生上调,约2 周后开始下降｡缺血性卒中早期,特别是最初 1 h,单独给予VEGF治疗有加重脑水肿的风险,这可能与脑血管通透性增加有关,而脑缺血再灌注发生后24 ~ 72 h给药表现出更有益于血管生成与神经功能恢复的结果｡

2. 2 NO-环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)通路

NO是生物体内一种重要的信号分子与生物自由基,产生于包括脑组织在内的多种组织中｡在脉管系统中,NO 主要由内皮型 NO 合成酶催化产生,内皮型 NO合成酶首先在相关蛋白激酶的作用下激活,而后进一步氧化L-精氨酸产生NO.另外,NO作为激活因子可以活化可溶性鸟苷酸环化酶,使三磷酸鸟苷迅速完成向cGMP的转化,进而通过激活蛋白激酶G 促进下游信号的传导｡NO-cGMP通路可以刺激细胞内Ca2 +浓度下降从而松弛平滑肌细胞,并改变其细胞骨架,促进血管的扩张和通透性增加｡

缺血性卒中发生后,NO-cGMP通路介导的血管通透性增加促使血浆蛋白渗出,为血管内皮细胞的迁移提供了移动媒介｡此外,NO和cGMP的生成能够促进VEGF等血管生长因子的的血管生成活性,以及诱导血管外基质的重塑｡因此,NO-cGMP通路被认为是脑侧支血管生成过程中的早期通路｡在大鼠MCAO 24 h 内,特别是最初 1 ~ 2 h,内皮型NO合成酶产生的 NO能够改善梗死周围区内的脑血流量,减少梗死体积｡而在大鼠缺血再灌注模型中,给予5 型磷酸二酯酶抑制剂可以抑制cGMP的水解,增加缺血区脑血流量并改善神经功能｡

2. 3 Notch信号通路

典型的 Notch 信号通路由其配体Jagged1､Jagged2､Delta-like1､Delta-like3､Delta-like4以及受体Notch1､Notch2､Notch3､Notch4 及CSL-DNA 结合蛋白和靶基因组成｡当同样作为Ⅰ 型跨膜蛋白的Notch配体､受体结合后,受体蛋白经过γ-分泌酶复合物以及去整合素-金属蛋白酶的数次剪切后释放胞内结构域,结构域进一步转移至细胞核并与转录因子CSL结合,共同激活下游靶基因,改变细胞功能｡Notch信号通路主要介导的是细胞间的信传递,是通过相邻细胞的相互作用来调控细胞的生理过程｡

研究显示,由配体Delta-like4与Notch受体结合形成的 DLL4-Notch 通路在脑侧支血管生成过程中与VEGF-VEGFR通路协同发挥作用｡当VEGFA水平上升时,部分内皮细胞根据位置的不同,分别分化为尖端细胞和躯干细胞,尖端细胞以丝状突起的形式向细胞外基质延伸,促进血管出芽｡同时,VEGFA诱导尖端细胞合成Delta-like4,激活相邻躯干细胞中的 Notch信号,使其进一步活化,诱导新生血管的萌出或分裂,协助 VEGF-VEGFR通路促进管腔及血管网络的形成｡此外,配体Jagged1 及其受体Notch1在人脑梗死灶周围区域大量增加,而小鼠MCAO模型中,慢病毒介导的 Notch1敲除可以减少脑缺血诱导的侧支血管生成｡

2. 4 血管生成素(angiopoietins,Ang)-Tie2通路

Ang是对血管发育及成熟具有重要作用的生长因子｡其中,Ang-1主要在血管周细胞中表达,以多聚体的形式作用于血管内皮细胞和周细胞中具有表皮生长因子同源结构域的酪氨酸激酶受体Tie2｡结合Ang-1后,Tie2会启动自身磷酸化,并进一步激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylineosi-tol-3kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)等信号通路,促进内皮细胞及周细胞的增殖与迁移,共同维持脉管系统的稳定｡Ang-2 与Tie2 的结合活性低于Ang-1,但可一定程度上抑制Ang-1与Tie2的结合,在VEGF分泌不足时,Ang-2 可诱导血管的损伤｡因此,Ang-1､Ang-2 的表达水平以及与Tie2受体的结合情况对血管的生成与稳定具有重要作用｡

急性缺血发生后,由于转录调控以及某些调节因子(如Src家族酪氨酸激酶)的作用,Ang2的活化数量明显增加,而Ang-1和Tie2相对缺乏,从而导致Ang-1与Ang-2的比例平衡遭到破坏,血液定量分析结果表明,Ang-2､Tie2 的表达水平与脑缺血的严重程度有关;随着缺血性卒中的进展,特别是再灌注发生后,缺氧环境和VEGF等生长因子可激活和聚集Tie2,Ang-Tie2通路被激活,进而刺激血管内皮细胞和周细胞的活动性增加｡此外,活化的内皮细胞可以分泌血小板衍生生长因子BB并作用于周细胞质膜上的相应受体,进一步募集周细胞｡与VEGF-VEGFR通路侧重于调控血管的萌出与生长不同,Ang-Tie2通路的作用更多表现在促进新生血管的成熟与稳定｡

2. 5 PI3K-Akt通路

Akt是一种丝氨酸或苏氨酸蛋白激酶,是PI3K的下游因子,两者组成的通路是细胞内的重要信号通道,主要介导细胞活化､增殖､凋亡等活动｡在酪氨酸激酶受体或部分细胞因子受体经配体结合激活后,胞内的 PI3K经诱导向质膜转移,与4,5-二磷酸磷酯酰肌醇结合促使其磷酸化,转化为1,4,5-三磷酸磷酯酰肌醇,进一步结合Akt后,通过诱导下游信号途径的磷酸化,参与调控细胞功能｡其中,雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)作为许多信号途径中的效应分子,同样是该通路一个重要的下游靶点蛋白｡

脑侧支血管生成过程中,参与激活 VEGF-VEGFR通路的 HIF-1是一种异二聚体转录蛋白,脑组织缺血缺氧发生后,其亚基HIF-1α的表达水平迅速升高,在8 ~ 24 h内达到峰值,最终恢复到正常水平｡PI3K-Akt-mTOR信号通路可以作用于HIF-1α,使其与细胞核中转运蛋白HIF-1β相结合,并激活低氧反应相关基因,促进VEGF等血管生长因子的表达｡在氧糖剥夺离体人脑微血管内皮细胞中,PI3K-Akt-mTOR通路的激活可以诱导细胞的活化与迁移,给予通道抑制剂LY294002 可以消除这种作用｡此外,PI3K-Akt 通路能够调节 NO 信号通路,促进NO从血管内皮细胞中释放,发挥促血管生成的作用｡

3 缺血性卒中侧支血管生成治疗性干预

3. 1 微小核糖核酸(micro RNA,miRNA)

miRNA是一类非编码单链RNA小分子,能够与靶基因信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)非翻译区结合,促使其mRNA降解或翻译阻滞,负性调控转录后基因的表达｡基于miRNA的治疗药物包括模拟miRNA 前体的双链寡聚核苷酸､与miRNA高度互补的单链反义寡聚核苷酸以及通过调节miRNA功能而发挥神经保护作用的部分药物｡

研究表明,miR-107､miR-210､miR-376b-5p､miR-140-5p等几种miRNA 对脑侧支血管生成起重要作用｡大鼠MCAO 后,HIF-1 刺激脑内miR-107水平上升,miR-107通过上调 VEGF的表达促进侧支血管生成,使用miR-107 抑制剂可以减少梗死周围区的微血管数量｡缺血性卒中后,miR-210转录增加,miR-210 通过上调 VEGF 水平和激活Notch信号通路,促进微血管网的形成｡而在大鼠MCAO 模型中,miR-376b-5p 抑制了脑缺血后的侧支脑血管生成,作用机制与抑制HIF-1 诱导的VEGFA增加以及VEGFA 对DLL4-Notch 通路的激活有关｡miR-140-5p 则直接作用于VEGFA mRNA的 3’非翻译区,抑制其转录后表达｡目前,尚无miRNA 药物被应用于临床治疗,但由细胞外囊泡构建的内源性递送系统在动物实验中取得了成功,或可以通过静脉注射载有miR-210 的细胞外囊泡 RGD-exo 将miR-210 传递到缺血脑区,诱导血管生成｡

3. 2 干细胞

干细胞移植的治疗方法在神经系统疾病中正被广泛研究,其在缺血性动物模型以及临床试验中表现出有益的作用,体现在神经保护､神经发生､血管生成､免疫调节以及抗炎作用等多个方面｡

骨髓单核细胞移植可以调节局部或全身炎性反应,促进血管生成､神经发生及神经营养因子的分泌,其中,分化为内皮细胞是其修复缺血性损伤的主要机制｡有临床研究结果表明,缺血性卒中后尽早静脉输注自体骨髓单核细胞,有利于缺血性卒中患者神经功能缺损症状的恢复｡骨髓间充质干细胞除直接分化为内皮细胞外,还可通过PI3K-Akt等信号通路增加VEGF 等血管生成因子的表达,促进脑侧支血管的生成,再通过诱导周细胞､平滑肌细胞的增殖与迁移,进一步促进新生血生管网的成熟｡一项为期2 年的临床研究纳入了18 例缺血性卒中后6 ~ 60 个月存在慢性运动障碍的患者,平均分成3 个队列,通过MRI 立体定位技术将一种异体修饰的骨髓间充质干细胞——SB623 细胞分别以2. 5 × 106 个､5. 0 × 106 个和10. 0 × 106 个3 种剂量单次注射到患者梗死区,所有患者未出现死亡或遗留后遗症,且完成24 个月治疗的 16 例患者慢性运动障碍均得到改善｡培养的神经干细胞移植也是修复脑组织缺血性损伤的有效方法,神经干细胞能够提供VEGF 等治疗性基因产物以促进脑侧支血管生成,同时VEGF 可以进一步激活 PI3K-Akt 等通路进而改善神经功能｡一项研究纳入了23 例缺血性卒中后2 ~ 13 个月有明显上肢运动缺陷的 40 岁以上患者,结果表明,脑内植入人类神经干细胞后12 个月的随访中未发生细胞相关不良事件,2 例死亡与试验程序无关;14 例患者上肢运动功能在移植后3､6 和12 个月随访时有所好转｡此外,干细胞在充当基因传递载体的同时,也分泌各种神经营养因子｡在大鼠缺血性卒中模型中,移植过表达VEGF 等各种生长因子或细胞因子的基因修饰干细胞能显著促进神经功能恢复｡

在缺血性卒中急性期(发病1 周内),与脑内植入相比,静脉或动脉注射干细胞规避了脑部手术风险的同时还能够提供更多的细胞数量,但存在肺､脑微血管栓塞的可能;而在慢性期(发病6 个月后),脑内植入可能取得更好的效果,但侵入性治疗带来的损伤无法评估｡此外,干细胞类型､细胞移植剂量以及患者的特异性都会影响治疗效果｡

3. 3 中草药

近年来,中草药在治疗部分疑难疾病中表现出新的活力｡天麻素､葛根素､丹红注射液等已经成功应用于缺血性卒中的临床治疗｡此外,人参皂苷Rg1 作为人参的一种活性成分,可通过PI3K-Akt-mTOR 信号通路增加VEGF 的表达,促进缺血性卒中后的脑血管生成｡白藜芦醇是植物中提取的一种非黄酮类多酚抗毒素,在缺血性动物模型中能够激活 PI3K-Akt 等信号通路增加脑血流量,减小梗死体积｡梓醇是地黄的有效成分之一,能够作用于HIF-1α-VEGF 通路,促进血管内皮细胞增生,保护血管结构,诱导侧支血管生成｡XQ-1H 是由银杏内酯B 修饰得到的一种新合成化合物,近期研究中发现其通过PI3K-Akt 通路促进了脑缺血小鼠的脑血管生成,且该通路的特异性抑制剂可以阻断此效应｡

许多中草药及其制剂在临床前研究中表现出显著的治疗效果,但并未成功完成临床转化,这或与血-脑屏障的限制以及人体的吸收代谢等因素相关｡利用细胞外囊泡､聚合物分子等纳米载体材料将中草药有效成分或单体输送至缺血区域,可能更有利于实现其神经保护作用｡加强中草药有效成分及其配伍关系的研究,或将是未来的重点｡

脑侧支血管生成是一个复杂的病理过程,在缺血性卒中的各个时期,均受到多种信号通路的协同调控｡同时,多种血管生成因子､神经递质以及胞内的辅助蛋白､下游靶点蛋白也参与到信号的调节过程中｡因此,从信号传导的角度来分析其机制对发现新的治疗靶点十分必要｡目前,越来越多针对缺血性卒中的新疗法被应用到各种研究之中,显现出了巨大的潜力｡而不同治疗方法之间的组合,如中草药与外源性干细胞移植,以及与血管内治疗等方法的联合应用,可能会为脑侧支血管生成以及缺血性卒中的治疗带来更多可能｡