非小细胞肺癌（NSCLC）是一种高发病率和高死亡率的恶性肿瘤，吉非替尼等表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）是治疗NSCLC的重要手段，但长期使用会导致耐药现象的产生。越来越多的研究表明，细胞自噬与肿瘤耐药密切相关，其可有利于肿瘤细胞在不利环境下继续存活，促进肿瘤细胞生长。
泻白散出自《小儿药证直诀》具有清脏腑热，清泻肺热，止咳平喘之功效，临床上常用于治疗感冒、哮喘、肺炎和肺癌等疾病。
不久前，在《Phytomedicine》期刊发表的一篇名为“Xie-Bai-San increases NSCLC cells sensitivity to gefitinib by inhibiting Beclin-1 mediated autophagosome formation”的论文探究了泻白散治疗非小细胞肺癌吉非替尼耐药的核心机制。
图1 论文截图
泻白散抑制NSCLC吉非替尼耐药细胞的增殖
研究者首先采用低浓度诱导和慢病毒转染的方式构建了两株吉非替尼耐药的NSCLC细胞，命名为PC9-GR和PC9-M。通过CCK-8实验和克隆形成实验发现，无论泻白散是否与吉非替尼联用，均可抑制PC9-GR细胞和PC9-M细胞的生长。
研究者又选择4周龄NOD/SCID小鼠构建PDX模型，植入从EGFRL838V+L861Q突变和PIK3CAH1047L突变的肺腺癌患者胸腔积液中提取的肿瘤组织，造模成功后，将小鼠随机分为4组（n=5）：对照组、吉非替尼（10mg/kg/d）组、XBS（10.9g/kg/d）组和吉非替尼+XBS组。灌胃给药16天后处死所有小鼠取出肿瘤进行分析发现，XBS与吉非替尼联合使用可显著抑制异种移植瘤的生长。另外，透射电镜显示XBS与吉非替尼联合使用可导致肿瘤细胞自噬囊泡减少。
3
图2 泻白散抑制NSCLC吉非替尼耐药细胞的增殖
泻白散抑制NSCLC吉非替尼耐药细胞的细胞自噬
紧接着，研究者对自噬相关蛋白进行了检测发现，单用吉非替尼可以显著增加LC3-Ⅱ的蛋白表达，降低P62/ SQSTM1的蛋白表达；XBS与吉非替尼联合，可抑制LC3-Ⅱ的蛋白表达，促进P62/ SQSTM1的蛋白表达。通过mCherry-GFP-LC3评估发现，XBS的处理显著减少了GFP和mCherry的荧光斑点，这表明XBS可能可以抑制细胞自噬。
图3 泻白散抑制NSCLC吉非替尼耐药细胞的细胞自噬
有文献表明，PI3K/mTOR信号通路、Beclin-1和 Bcl-2是开始自噬的关键。研究者发现XBS与吉非替尼的联合应用可上调p-Akt、p-mTOR和Bcl-2的蛋白表达，下调Beclin-1的蛋白表达。
图4 泻白散通过上调p-mTOR、 Bcl-2和下调 Beclin-1阻碍细胞自噬的开始
研究者随后又进一步对细胞内溶酶体关联膜蛋白1（LAMP1）的表达进行了评估，发现在PC9-GR细胞中吉非替尼和XBS的处理可以促进LAMP1的蛋白表达，但在PC9-M细胞中，各处理组并无显著差异，这提示细胞中自噬通量的降低可能与细胞内LAMP1表达的多少无关。同时，也对自噬体和溶酶体的融合进行了研究，通过LC3和LAMP1的共定位可知XBS的处理不影响自噬-溶酶体的形成；并且在对溶酶体的pH值检测时发现，无论XBS是单独使用还是与吉非替尼联合使用都不影响溶酶体的pH值。
图5 泻白散不干扰自噬体和溶酶体的融合
泻白散诱导NSCLC吉非替尼耐药细胞的凋亡
接下来，研究者通过流式细胞术结合PI染色发现，XBS和吉非替尼联合使用时可增加细胞凋亡。更进一步对凋亡相关蛋白检测发现，联合治疗组Bax/Bcl-2比值有升高趋势。
图6 泻白散诱导NSCLC吉非替尼耐药细胞的凋亡
研究者又选择BALB/C小鼠，将PC9和PC9-GR细胞通过皮下注射至小鼠右侧构建异种移植瘤模型。7天后，将小鼠随机分为6组：PC9组、PC9+吉非替尼组、PC9-GR组、PC9-GR+吉非替尼组、PC9-GR+XBS组和PC9-GR+XBS+吉非替尼组。分别给予生理盐水、吉非替尼（10mg/kg/d）和XBS（10.9g/kg/d）灌胃28天后处死小鼠，透射电镜发现XBS与吉非替尼联合使用，让肿瘤中的自噬囊泡显著减少。Western blot和免疫荧光进一步验证了自噬相关蛋白的变化，得出与体外实验相似的结论。
图7 泻白散对吉非替尼的增敏作用
上述结果表明，XBS通过上调p-mTOR和Bcl-2，下调Beclin-1抑制细胞自噬，从而抑制NSCLC吉非替尼耐药细胞的增殖。
参考文献：
Ma C, Zhang X, Mo X, et al. Xie-Bai-San increases NSCLC cells sensitivity to gefitinib by inhibiting Beclin-1 mediated autophagosome formation. Phytomedicine. Published online January 9, 2024. doi:10.1016/j.phymed.2024.155351.