【衡道丨笔记】FISH技术注意事项
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一、FISH荧光原位杂交
应用荧光染料标记的DNA/RNA探针,根据碱基互补配对的原则,与变性后的染色体或细胞核靶核酸杂交,在荧光显微镜下观察并记录结果。
二、FISH的工作原理
基因组DNA由两条互补分子链相结合组成;
为使探针能结合,双链DNA需要加热变性解链;
探针在杂交过程中与其互补序列相结合;
结合的探针通过荧光显微镜观察。
操作流程简图
确定读片区域——低倍到高倍
10x:切片位置、确定观察区域;
40x:扫描观察区域,观察背景、异质性,信号点强度和形状、选择计数区域;
100x:扫描计数区域、选择计数细胞,分辨信号并计数。
确定观察区域
选择计数细胞——细胞核选择
大小:较大
胞核边界完整
DAPI染色均一
细胞核无重叠
信号清晰及可读
使用双探针时,只计数每种颜色FISH信号≧1的细胞
结果描述
评估肿瘤细胞数量
肿瘤异质性评价
信号描述:点状、簇状,比值
分离探针:分离信号所占比例
三、FISH注意事项
1、检测前:
样本前处理标准化:
尽快取材固定;
4%中性缓冲甲醛(甲醛与氧化性物质接触后形成的甲酸,可改变环境pH;中性缓冲型甲醛固定剂能有效中和甲醛氧化生成的甲酸,使环境pH得以稳定);
4-6μm切片厚度;
切片<6周,蜡块<2年;
盐酸脱钙影响杂交;
标本处理不当
固定时间6-48小时;
经过福尔马林固定后的交联会限制探针和试剂,使它们不能接近目的核酸。
福尔马林固定时间越长,发生交联的程度越高
2、检测中:
(1)抗原修复
去离子水:高温90℃(20-30min);高压煮沸(10min)
柠檬酸盐缓冲液pH6.0:高温90℃(20-30min);高压煮沸(10min)
EDTA缓冲液:高温90℃(20min)
(2)酶消化
胶原酶:1mg/ml
胃蛋白酶:低浓度20mg/ml(20min-1h);高浓度250mg/ml(1-10min)
蛋白酶K:200μg/ml(5-8min)
(3)变性 杂交
变性:73℃-85℃ 5-8min
孵育过夜:37℃-42℃ 16h(过夜湿度保持恒定)
检测后:
判读;报告;资料保存
四、总结
高质量的FISH结果:
仪器设备维护
熟悉病理组织学特点
操作人员规范培训
掌握实验优化条件