单细胞转录组测序技术在非小细胞肺癌免疫微环境分析中应用的研究进展
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根据2020年的数据[1]，肺癌是世界上第二常见的癌症，同时也是癌症死亡的最重要原因。与小细胞肺癌相比，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）更为常见[2]。NSCLC与肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TIME）有着极其复杂的关系，正常情况下微环境内的免疫细胞发挥抗肿瘤免疫的作用；在某些因素的作用下微环境内的免疫细胞组成及功能会发生变化，形成肿瘤细胞改变TIME、TIME促进肿瘤进展的恶性循环。单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）在NSCLC的TIME中有巨大的应用潜力，可用于评价不同阶段TIME变化、分析TIME基因组特征、评价免疫治疗效果和耐药性及其可能的机制。总之，scRNA-seq技术有望揭开NSCLC与TIME的复杂关系。
TIME是指肿瘤组织内的肿瘤细胞及各种免疫成分，主要包括肿瘤细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞及其分泌的各种因子。TIME可分为富含免疫细胞但肿瘤中心缺乏细胞毒性淋巴细胞的浸润-排除型TIME、特异淋巴细胞高度浸润的浸润-发炎型TIME和包含大量多样性淋巴细胞的三级淋巴结构型TIME[3]。
首先，NSCLC可通过分泌各种细胞因子和趋化因子或者影响免疫细胞的表达及其分布来巧妙地控制其周围环境。NSCLC发展过程中会使肿瘤细胞产生大量的抗原，这些抗原会激活体内的免疫系统进而杀死癌细胞并释放更多新的抗原，如此循环往复，不断改变TIME的构成[4]。其次，NSCLC可影响TIME内免疫细胞数量和活性。Kargl等[5]发现NSCLC组织内的免疫细胞数量是非相邻肺组织的3倍；Kim等[6]发现NSCLC细胞分泌的外泌体可抑制T细胞活性；Oh等[7]发现NSCLC内雌激素和孕激素受体基因的高表达可使T细胞浸润减少。NSCLC细胞分泌免疫抑制因子抑制细胞毒性T淋巴细胞的细胞因子分泌，并作用于调节性T淋巴细胞，间接抑制细胞毒性T淋巴细胞的增殖和分化[8]。此外，Chen等[9]也发现NSCLC细胞膜上的钙网蛋白可促进肺癌组织中的树突状细胞浸润来抑制肺癌进展。总之，NSCLC可以通过各种机制改变TIME的构成，影响TIME的功能。
不仅NSCLC促进TIME形成，TIME也会促进NSCLC的生长、侵袭和转移。多项研究[10-12]均发现肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAM）同时具有促肿瘤和抑制肿瘤的双重作用。除TAM外，Casanova-Acebes等[13]发现组织驻留巨噬细胞可促进肿瘤细胞的上皮-间质转化，使肿瘤细胞获得较强侵袭性。Aloe等[14]发现中性粒细胞分泌的中性粒细胞弹性蛋白酶可通过调节基质金属蛋白酶-9的活性影响肿瘤的侵袭性。Najafi等[15]也发现Th17细胞会导致抗肿瘤免疫的消散，促进肿瘤进展。综上所述，NSCLC可促进TIME形成，同时TIME促进NSCLC的进展，不断将NSCLC推向晚期。这些发现成为开发免疫治疗的基础，而scRNA-seq技术的应用有望发现更多免疫治疗方法。
scRNA-seq技术是指通过对单个细胞转录测序分析，识别生物体内各种细胞的转录特征，了解各个细胞的表达基因及代谢产物，并进行数据分析，scRNA-seq能够高分辨率分析肿瘤浸润细胞的分子特征。
对分离和捕获的目标细胞进行单细胞捕获是scRNA-seq技术的第一步，分离单个细胞的常用方法包括将细胞液进行倍比稀释的有限稀释技术、用显微操作器在显微镜下进行细胞操作的显微操作技术、使用特定表面标记的荧光单克隆抗体标记细胞的荧光激活细胞分选技术、在计算机帮助下使用激光系统分离细胞的激光捕获显微切割技术以及操作极少量流体分离细胞的微流体技术，此外CellSearch专门开发了一项获取循环肿瘤细胞的技术[16]。
细胞裂解是scRNA-seq的一种重要方法，大多数细胞裂解技术通过化学或物理方法破坏细胞。细胞裂解之后需首先捕获mRNA，对捕获的mRNA进行逆转录合成双链cDNA。单个细胞的DNA含量一般达不到基因测序的需要，因此需要对基因组进行扩增。目前常见的DNA扩增方法包括基于PCR的DNA片段扩增、基于位点置换扩增的DNA片段扩展以及基于多重退火环状循环扩增的DNA片段扩展[17]。
文库建立：（1）用mRNA制备cDNA；（2）使用各种酶促使cDNA片段化；（3）修复这些DNA片段的末端并添加A核苷酸；（4）使用接头特异性引物扩增和纯化样品用于测序[18]。将单个细胞来源的、经过扩增的cDNA汇集并通过高通量下一代测序技术（next-generation sequencing，NGS）进行测序。NGS区别于第一代Sanger测序技术的特点是，在执行大规模并行测序的同时执行大量的、单独的测序，目前常用的第二代测序技术较为成熟，包括通过合成进行短读测序、离子半导体测序和纳米球测序[19]。
一般来说，基因组测序所得原始数据以FASTQ文件格式保存，其后将所得数据与参考基因组进行对比[20]，找出其中的基因变异，并获得一个序列比对图文件及其二进制格式BAM文件。综合基因组学查看器可对BAM文件进行可视化访问和处理[21]，同时其也非常适合NGS数据集的全基因组探索[22]。通过检测可识别插入缺失、单核苷酸和拷贝数变异等变异。之后必须对VCF文件中记录的变异进行注释以确定其生物学意义[23]。
scRNA-seq可分析TIME中各种细胞成分及其与正常微环境内单个细胞在基因层面的区别，被广泛应用于研究肿瘤细胞和各种免疫细胞的基因表达，有助于了解TIME在NSCLC进展过程中的重要作用。
随着NSCLC细胞的增殖，TIME也会动态改变，这将更有利于肿瘤的发展、浸润和转移。scRNA-seq技术能够分析不同阶段NSCLC的TIME组成和功能变化。
采用scRNA-seq技术可以发现早期肺癌组织中免疫细胞数量发生明显变化。Lavin等[24]发现，早期肺腺癌组织富含PD-L1hiCD64hiCD14hiPPARγhiIL-6hi巨噬细胞、CD1c+DC、Treg和耗尽的T细胞，而缺乏CD141+DC、CD16+单核细胞、自然杀伤细胞和颗粒酶B+效应细胞。Kim等[25]发现，正常肺组织和早期肺腺癌组织分别富含促炎和抗炎巨噬细胞。Song等[26]通过轨迹分析发现，早期NSCLC普遍存在单核细胞向M2巨噬细胞分化。Lavin等[24]发现，早期肺腺癌的TAM表达更高水平的免疫调节转录因子PPARγ。此前的研究[27]表明，PPARγ可促进肿瘤的发展。
不同时期的肺癌组织内免疫细胞在数量、功能上存在明显异质性，采用scRNA-seq技术可以分析不同分期肺癌特征。Wu等[28]发现晚期肺鳞状细胞癌（鳞癌）内富含中性粒细胞，而晚期肺腺癌的中性粒细胞显著耗竭。肺腺癌是从非典型腺瘤样增生到原位腺癌、微浸润性腺癌，再到浸润性腺癌不断发展的[29]，而scRNA-seq技术可以对这一过程进行连续分析。Wang等[30]发现从正常肺组织到浸润性腺癌的进展过程中出现了T和B淋巴细胞的富集，自然杀伤细胞和粒细胞的减少，肺泡2型细胞标志物SFTPC的差异表达（在正常和早期肿瘤组织中高表达，在浸润期组织中表达明显减少），肺泡2型细胞在整个癌症进展过程中显示出逐渐增加的染色体获得/丢失事件，程序性细胞死亡受体-1的差异性表达（在非典型腺瘤样增生和原位腺癌阶段的pan-CK−细胞中高表达，在微浸润性腺癌和浸润性腺癌阶段的pan-CK+细胞中高表达）的特征。此外，对肺癌转移区域进行scRNA-seq分析也发现了不同的特征。Kim等[25]发现，肺腺癌转移性淋巴结中含有大量骨髓细胞，随着肺腺癌的发展，单核细胞衍生的巨噬细胞的比例明显增加，CD8+T细胞逐渐耗尽。Huang等[31]发现，晚期NSCLC患者的恶性胸腔积液中，细胞毒性T细胞消耗、Treg细胞出现、调节性B细胞显著富集，T滤泡辅助细胞和巨噬细胞中代谢相关基因的表达明显增加。总之，scRNA-seq可以用于研究不同阶段免疫细胞的异质性，通过比较彼此之间的差异揭示更多NSCLC中TIME的特征。
基因突变是肿瘤发生的基础，导致细胞失控地生长分化，通过改变为蛋白合成编码的基因活性而诱发癌症。通过scRNA-seq可发现NSCLC内基因突变。Kim等[32]在肺腺癌患者的异种移植物肿瘤细胞中发现包括Kras-G12D在内的单核苷酸突变；Xiong等[33]在小鼠肺鳞癌细胞中发现癌症基因反复发生突变。
在肿瘤发展过程中，基因差异化表达发挥至关重要的作用。使用scRNA-seq可以对单个细胞的表达进行高分辨率分析。Min等[34]在肺腺癌中发现G64基因过表达；Suber等[35]在NSCLC中发现了FBXO17过表达；Ma等[36]在肺腺癌中发现抗原呈递途径和IFN-γ信号通路等基因异质表达。此外，Kim等[25]发现从晚期活检或淋巴及脑转移灶中分离出的肿瘤细胞的特异性基因表达也增加。Wu等[28]发现与肺腺癌相比，肺鳞癌具有更高的瘤间和瘤内异质性。以上研究充分说明了不同阶段、不同类型的NSCLC表现出不同的基因表达特征，而这些表达特征又与肿瘤的发展、侵袭和预后息息相关。
了解疾病的预后有助于指导临床决策，使用scRNA-seq可发现有潜力的预后标志物。相关研究表明，ADAM12（P=0.014）[37]、IL1R2（P=0.000 5）[38]的表达预示了NSCLC的不良预后。scRNA-seq同样有构建多种基于各种基因和蛋白的预后模型及预后标志物的潜力[39]。此外，肺癌细胞生长极为活跃，侵袭性强，易致局部扩散和血道转移而影响预后，scRNA-seq可发现有潜力的转移标志物。Ruan等[40]发现，肺腺癌软脑膜转移患者的脑脊液内肿瘤细胞中CEACAM6（P<0.001）、SCGB3A2（P<0.001）和C3（P<0.001）表达明显上升，说明以上3种分子具有作为肿瘤转移标志物的潜力。综上所述，scRNA-seq具有发现基因突变、基因差异性表达和预后转移标志物的巨大潜力。
免疫检查点抑制剂通过阻断免疫检查点来诱导抗肿瘤免疫反应，代表了过去10年肿瘤学药物开发的重大突破。使用scRNA-seq可评价TIME对免疫检查点的影响。Van Damme等[41]发现，CCR8+ Treg细胞的特异性消耗可减缓肿瘤进展并增强免疫检查点阻断治疗的效能。除了免疫检查点，scRNA-seq还可以评估其他免疫治疗效果。Maroni等[42]检测NSCLC细胞在第二代BMI-1抑制剂PTC596治疗前后的数量变化（肿瘤细胞TEC-C8和TEC-C13分别减少为原来的18.0%和37.1%，并且肿瘤缩小了16.3%），发现PTC596可以作用于KRAS突变肺腺癌。Pan等[43]发现一种名为CA170的VISTA拮抗剂的抗肿瘤作用（与对照组相比，CA170治疗使肿瘤负荷降低了63%）。Leader等[44]发现一个由多种免疫细胞组成的肺癌激活模块（lung cancer activation module，LCAM），并且高LCAM评分的NSCLC患者对免疫治疗更敏感。scRNA-seq的应用有望发现并不断改进免疫治疗方法，提高NSCLC患者的生存状态和预后。
各种免疫治疗的应用极大改善了NSCLC的临床治疗结果，但耐药性也在大量患者中发现。免疫治疗的耐药机制主要包括内源性和外源性两大类，前者包括缺乏抗原蛋白和抗原呈递、T细胞排斥和对T细胞低敏感，后者包括缺乏T细胞、抑制性免疫检查点和抑制性免疫细胞[45]。使用scRNA-seq可以发现NSCLC免疫治疗耐药。Kim等[32]在肺腺癌异种移植物肿瘤细胞中发现了具有耐药特征的肿瘤细胞亚群；Suzuki等[46]也确定了一个对凡德他尼耐药的亚群，并发现产生耐药的亚群细胞核糖体基因和管家基因的相对表达降低，而直接靶向的表皮生长因子受体和RET基因保持不变。除了发现耐药性，scRNA-seq还可以发现潜在的耐药机制。此前的研究[47]已经证明葡萄糖转运蛋白（glucose transporters，GLUT）抑制剂可作为新型选择性抗癌药物。在此基础上Na等[48]联合包括scRNA-seq在内的多种方法分析肺鳞癌细胞，发现免疫不良的肺鳞癌细胞中氟代脱氧葡萄糖摄取与GLUT1正相关（r=0.27，P=0.04），并且抗程序性死亡受体-1应答者的GLUT比率显著高于无应答者（P=0.002），这提示GLUT比率可能与耐药性相关。总之，应用scRNA-seq技术不仅可以发现耐药性，同时也可以揭示其背后的机制。
近年来scRNA-seq技术已成为剖析NSCLC中细胞异质性的重要工具。使用这一工具可以提高我们对NSCLC的TIME中细胞类型、细胞演变轨迹、细胞分化的分子机制及细胞之间调节作用的认识。目前，scRNA-seq多对mRNA进行分析，对包括microRNA等的非mRNA的分析在未来可能会揭示更多NSCLC的异质性。将scRNA-seq与其他分析方法结合，整合来自同一细胞的不同分子和细胞信号将能够克服scRNA-seq技术本身的不足。许多研究报告了scRNA-seq在肺癌研究中的应用，但仍有一些挑战需要克服。从不同肺组织中分离足够数量的细胞需要进行机械或化学操作，该过程可能很难得到功能完好无损且无菌的单个细胞进行scRNA-seq分析，这极大影响了scRNA-seq分析的精准度。高昂的成本以及复杂的步骤也限制了scRNA-seq的广泛应用。对海量scRNA-seq数据进行生物信息学分析也是一项巨大的挑战。虽然scRNA-seq技术有其不足之处，但不可否认的是，scRNA-seq技术依然将是未来NSCLC研究的热点。同时也期待在细胞分离技术、scRNA-seq技术以及生物信息分析技术等方面有更多的进展和突破，使scRNA-seq技术在NSCLC的研究中得到更普遍的应用。
综上所述，单细胞基因组学对于绘制肿瘤生态系统至关重要。近年来scRNA-seq技术的迅速发展使得我们对NSCLC的TIME产生了更加深刻的认识，在大多数研究中scRNA-seq技术展现出优秀的应用前景。总之，scRNA-seq是NSCLC的TIME研究中的强大工具，有助于了解不同阶段NSCLC中TIME的细胞和分子机制。scRNA-seq还可用于分析NSCLC基因组特征及预后。此外在分析免疫治疗及其耐药性方面，scRNA-seq也有着其独特优势。尽管技术和生物信息学方面的挑战可能会限制scRNA-seq在NSCLC TIME研究中的应用，相信随着技术的进步和成熟，更多scRNA-seq的研究将进一步揭开NSCLC中TIME的奥秘。
原始出处：
杨文文, 何立, 张敏, 孙硕, 王峰, 马敏杰, 韩彪. 单细胞转录组测序技术在非小细胞肺癌免疫微环境分析中应用的研究进展. 中国胸心血管外科临床杂志, 2024, 31(3): 467-472. doi: 10.7507/1007-4848.202206064